Selección por mutagénesis y optimización de la fermentación de levaduras cerveceras productoras de glutatión extracelular

 El glutatión (GSH), o γ-glutamil-L-cisteína-glicina, es un aminoácido compuesto por tres aminoácidos (glutamato, cisteína y glicina) en la glutamilcisteína sintetasa y la glutatión sintetasa

El GSH es un tripéptido tiol no proteico sintetizado bajo acción continua [1], que desempeña un papel importante en la protección de las células frente al daño antioxidante y en el mantenimiento de la homeostasis intracelular [2-4].El GSH se utiliza ampliamente en campos industriales como la alimentación [5-7], la cosmética [8] y la industria farmacéutica [9-12], y puede emplearse como antioxidante y agente aromatizante, que puede prevenir eficazmente el oscurecimiento de los alimentos y mantener el sabor único de los mismos [13-16], y puede utilizarse como eliminador de radicales libres, que puede proteger el riñón y mejorar la desintoxicación del hígado [17-18].El GSH también puede utilizarse como eliminador de radicales libres, que puede proteger el riñón y mejorar la desintoxicación del hígado [17-18]. También puede utilizarse como eliminador de radicales libres, que puede proteger el riñón y mejorar la capacidad de desintoxicación del hígado [17-18].

 

La fermentación microbiana es actualmente el método más común para la producción industrial de GSH [19-20], sin embargo, como producto intracelular, la productividad y los beneficios económicos de la extracción de GSH aguas abajo de la fermentación no pueden satisfacer eficazmente la demanda del mercado, lo que restringe en cierta medida el desarrollo de su industrialización. Si el GSH intracelular de las cepas fermentadoras puede secretarse eficazmente al extracelular, el GSH purificado puede prepararse directamente en el caldo de fermentación, lo que simplifica el proceso de extracción y reduce la dificultad del aislamiento y la purificación del GSH aguas abajo, mejorando así la productividad del GSH. Si el GSH intracelular se puede secretar eficazmente al extracelular, entonces el GSH se puede preparar y purificar directamente en el caldo de fermentación, lo que simplifica el proceso de extracción y reduce la dificultad del aislamiento y la purificación del GSH aguas abajo, mejorando así la productividad del GSH. En los últimos años, la forma de obtener cepas de fermentación extracelulares productoras de GSH ha atraído la atención de estudiosos nacionales y extranjeros[21] . Por ejemplo, el uso de la tecnología de ingeniería genética para mejorar el transporte extracelular de GSH por las cepas de fermentación[22-24] , o para mejorar la permeabilidad de la membrana celular para promover la exocitosis y la acumulación de glutatión. Sin embargo, el coste de modificación y los requisitos técnicos para la construcción de bacterias de ingeniería del glutatión fermentado extracelularmente son elevados, y la regulación de la permeabilidad de la membrana celular es un método de penetración química de reactivos orgánicos[25], que no es adecuado para la producción industrial teniendo en cuenta el impacto sobre la actividad de crecimiento de las cepas y el medio ambiente.

 

La técnica tradicional de cría por mutagénesis UV no sólo es sencilla y rápida para seleccionar las cepas diana, sino que también garantiza la estabilidad genética de las cepas mutantes[26] , sin embargo, en el estudio actual sólo se seleccionaron por mutagénesis UV cepas mutantes productoras de glutatión intracelular, pero no cepas mutantes productoras de glutatión extracelular[27-29] . Por lo tanto, en el presente estudio, utilizamos Saccharmyces cere- visiae GAQ4 como cepa de partida, y seleccionamos una cepa mutante genéticamente estable con alta producción de glutatión extracelular mediante mutagénesis UV, y aumentamos aún más la producción extracelular de GSH optimizando las condiciones de fermentación, con el fin de proporcionar una nueva referencia para la estrategia de fermentación extracelular de GSH y lograr la producción industrial de fermentación extracelular de GSH. También optimizamos las condiciones de fermentación para aumentar aún más la producción extracelular de GSH.

 

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales y reactivos

Saccharomyces cerevisiae GAQ4: fermentación industrial en el Laboratorio Clave del Ministerio de Educación, Universidad Tecnológica de Hubei, Centro Provincial de Innovación Colaborativa de Hubei, Laboratorio A610.

Glucosa, levadura en polvo, peptona, sulfato de amonio, dihidrogenofosfato de potasio, sulfato de magnesio anhidro, agar en polvo, ácido fosfórico (todos analíticamente puros): Sinopharm Chemical Reagent Corporation; 1-heptanesulfonato de sodio, glutatión (todos analíticamente puros): Shanghai McLean Biochemistry Technology Co.

 

1.2 Instrumentos y equipos

Banco de trabajo de purificación simple SW-CJ-1D: Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; Incubadora bioquímica automática ZSD-12: Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Co. Ltd; Medidor universal de pH Sartorius (PB-10): Sartorius (Shanghai) Trading Co., Ltd; Horno electrotérmico de secado por chorro a temperatura constante: Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co.

 

1.3 Método de ensayo

1.3.1 Métodos de cultivo

Medio líquido de siembra: glucosa 20 g/L, peptona 20 g/L, polvo de hornear 10 g/L, pH natural.

Medio sólido de siembra: glucosa 20 g/L, peptona 20 g/L, bicarbonato sódico 10 g/L, agar 20 g/L, pH natural.

Medio de fermentación: glucosa 20 g/L, levadura 10 g/L, sulfato de amonio 8 g/L, dihidrogenofosfato de potasio 3 g/L, sulfato de magnesio 0,15 g/L, pH natural.

Cultivo de semillas: Tomar la suspensión conservada en tubos de glicerol e introducirla en el medio de siembra, e incubarla a 30 ℃ y 180 r/min en matraz de agitación.

Cultivo de fermentación: Tomar la savia de la semilla en periodo de crecimiento logarítmico y ponerla en el medio de fermentación con un volumen de inóculo del 10% en volumen, e incubarla bajo la temperatura de 30 ℃ y la velocidad de 180 r/min de agitación de la botella.

 

1.3.2 Mutagénesis ultravioleta

Proceso de mutagénesis: Precalentar la lámpara UV de 15 W durante 20 min. Tomar la suspensión bacteriana de siembra en el período de crecimiento logarítmico, diluir la suspensión bacteriana hasta el número de células de 107 UFC/mL~108 UFC/mL, tomar 200 μL de la solución de dilución y extenderla sobre el medio sólido de siembra, a continuación, colocar inmediatamente la placa de medio a una distancia de 30 cm de la lámpara UV para la irradiación UV, el tiempo de irradiación fue de 10, 20, 30, 40, 50 y 60 s, y cada grupo se estableció en 3 paralelos, y se contó el número de colonias bacterianas individuales crecidas en cada placa. Inmediatamente después de la irradiación, las placas se colocaron boca abajo en una incubadora a 30 ℃ para evitar la luz, y se contó el número de colonias individuales crecidas en cada placa. La suspensión bacteriana diluida sin irradiación UV se extendió sobre medio sólido y luego se incubó en el grupo de control, que estaba protegido de la luz. Se calcula la letalidad mutagénica UV, utilizando el tiempo de irradiación UV como coordenada horizontal y la letalidad mutagénica UV como coordenada vertical, y se traza la curva de letalidad mutagénica UV. La fórmula para calcular la letalidad mutagénica es la siguiente.

 

Letalidad mutagénica/% = (número de colonias en la placa de control - número de colonias en la placa mutagenizada)/número de colonias en la placa de control × 100.

Mutagénesis UV iterativa: Utilizando el contenido extracelular de GSH de la cepa como índice de cribado, GAQ4 se sometió a mutagénesis UV iterativa, es decir, las cepas mutantes que cumplían los índices de cribado obtenidos en la mutación anterior se utilizaban como cepas de partida en la siguiente mutación y, a continuación, se volvía a realizar el cribado de mutaciones. Se establecieron tres grupos paralelos para cada mutación con el fin de obtener un número suficiente de mutantes y aumentar la tasa de mutación positiva. Cada mutagénesis UV debe trazarse con la curva letal mutagénica UV, a fin de seleccionar la dosis mutagénica óptima para cada generación de cepas mutantes.

 

Prueba de estabilidad genética: Para confirmar que las cepas diana obtenidas tienen una buena estabilidad genética, las cepas diana seleccionadas se pasaron sucesivamente durante 8 veces, y el cultivo de fermentación se llevó a cabo en la 1ª, 4ª y 8ª generaciones, y el contenido de glutatión extracelular de la producción de fermentación se midió frente al control de la cepa de partida GAQ4. 1.3.3 Prueba unidireccional de las condiciones de fermentación

Se realizó una prueba unidireccional para investigar los efectos del período de fermentación, el volumen del matraz de agitación, el pH inicial, la temperatura de fermentación y la velocidad del matraz de agitación sobre el contenido extracelular de GSH producido por la fermentación en matraz de agitación de las cepas mutantes, utilizando el contenido extracelular de GSH como indicador. La temperatura de fermentación fue de 26, 30, 34, 38 y 42 ℃, y la velocidad de rotación del matraz de agitación fue de 120, 140, 160, 180 y 200 r/min. Se optimizaron las condiciones óptimas de fermentación en matraz de agitación de la cepa mutante, y se tomaron los valores medios de cada factor para determinar las condiciones óptimas de fermentación en matraz de agitación en tres configuraciones paralelas.

 

1.3.4 Medición de la biomasa

Un cierto volumen de suspensión bacteriana se centrifugó a 8000 r/min durante 5 min para recoger el cuerpo bacteriano húmedo, y el cuerpo bacteriano se lavó con agua estéril durante 3 veces, y luego se secó en un horno a 65 ℃ hasta peso constante, y luego se pesó para obtener el peso seco de las células, y la biomasa se calculó mediante la siguiente fórmula.

Biomasa/(g/L) = peso seco celular (g) / volumen de suspensión bacteriana (L)

 

1.3.5 Determinación del glutatión

El contenido de GSH se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [30]. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: la columna fue Inertsil ODS-SP C18, y las fases móviles fueron tampón heptanosulfonato-fosfato sódico (6,8 g de 1-heptanesulfonato sódico, 2,2 g de fosfato potásico, pH 3,0 ajustado con ácido fosfórico, y metanol (90:10 tampón fosfato a metanol, relación de volumen) a un caudal de 1,0 mL/min. Las fases móviles fueron solución amortiguadora de heptanesulfonato-fosfato de sodio (6.8 g de 1-heptanesulfonato de sodio, 2.2 g de dihidrogenofosfato de potasio, pH 3.0 ajustado con ácido fosfórico, y agua ultrapura se ajustó a 1 L) y metanol (la relación de volumen de amortiguador de fosfato a metanol fue 90:10) a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min.

Se pesaron 10 mg de estándar de glutatión, se diluyeron a 10 mL con agua ultrapura, y luego se diluyeron a las concentraciones de 200, 400, 600, 800 y 1 000 mg/L. Las áreas de pico correspondientes a las diferentes concentraciones de GSH se detectaron por HPLC, y la curva estándar se trazó con la concentración de GSH como la coordenada horizontal y el área de pico como la coordenada vertical, y se obtuvo la curva de regresión. La curva estándar se trazó con la concentración de GSH como coordenada horizontal y el área del pico como coordenada vertical (Figura 1), y la ecuación de regresión de la curva estándar fue y=18 045x+168 919 con R2 =0,999 3, que se utilizó para el cálculo del contenido de GSH.

 

2 Resultados y análisis

2.1 Resultados de la cría por mutagénesis

 

2.1.1 Contenido extracelular de GSH de la cepa de salida GAQ4

El contenido de glutatión extracelular de GAQ4 fue de 7,37 mg/L tras la fermentación en matraz agitado durante 48 h. El contenido de glutatión extracelular de GAQ4 se utilizó como indicador de la cepa de partida, y el contenido de glutatión extracelular de GAQ4 se comparó con el del mutante obtenido por mutagénesis.

 

2.1.2 Resultados del cribado por mutagénesis UV

Utilizando el contenido extracelular de GSH como índice de cribado, la cepa de partida GAQ4 se sometió a mutagénesis iterativa UV según el método de 1.3.2. Los resultados del primer cribado de mutagénesis UV se muestran en la Fig. 2.

Se seleccionaron un total de 200 colonias individuales tras el primer tratamiento de irradiación UV, y se seleccionaron 15 cepas mutantes de las cepas de cribado primario basándose en el alto contenido de glutatión extracelular tras la fermentación (Fig. 2B), entre las cuales el contenido de glutatión extracelular de la mutante UV1-6 era de 13,87 mg/L, que aumentaba un 88,20% en comparación con el de la cepa de partida, y se seleccionó para continuar el cribado por mutagénesis UV. La cepa mutante UV1-6 fue seleccionada para continuar el cribado por mutagénesis UV.

 

La mutante UV1-6 se utilizó como cepa de partida para la segunda mutagénesis UV, y los resultados del segundo cribado de mutagénesis UV se muestran en la Fig. 3. A partir de la Fig. 3A, se puede ver que la cepa mutante mostró una tasa letal del 78,6% cuando se irradió con UV durante 30 s, que es superior a la de la mutagénesis anterior a la misma dosis, por lo que seguimos optando por utilizar la misma dosis de irradiación UV para el segundo tratamiento de mutagénesis UV.

Como se muestra en la Fig. 3B, se seleccionaron 14 cepas mutantes con un contenido relativamente alto de glutatión extracelular tras el segundo cribado de mutagénesis UV, entre las cuales la cepa mutante UV2-2 tenía un contenido de glutatión extracelular de 16,10 mg/L, que era un 118,45% y un 16,08% superior al de la cepa de partida GAQ4 y la cepa mutante UV1-6, respectivamente.

El mutante UV2-2 se sometió a un tercer tratamiento de mutagénesis UV, y los resultados se muestran en la Fig. 4.

 

Como se muestra en la Fig. 4A, la letalidad de la tercera mutación UV aumentó obviamente tras la misma dosis mutagénica, y la letalidad alcanzó el 69,5% a los 10 s de irradiación UV, y el 81,9% a los 20 s de irradiación UV, por lo que se eligieron 15 s de irradiación UV como tiempo de tratamiento de la tercera mutación. Tras el cribado, se obtuvieron 11 mutantes con alto contenido extracelular de GSH. Como se muestra en la figura 4B, el contenido extracelular de GSH del mutante UV3-10 obtenido de la tercera mutagénesis fue de 19,08 mg/L, un 158,89%, 37,56% y 18,51% superior al de la cepa de partida, el mutante UV1-6 y el mutante UV2-2, respectivamente. A través del análisis anterior, el efecto de mutación positiva de la tercera mutagénesis no era tan obvio como el de las dos anteriores, y el contenido de glutatión extracelular de sólo un pequeño número de mutantes cribados se incrementó, y el contenido de algunos mutantes fue incluso menor que antes de la tercera mutagénesis, y la letalidad de la mutagénesis UV bajo la misma dosis mutagénica aumentó gradualmente, que estaba más allá del rango de letalidad de mutación positiva de alta probabilidad, por lo tanto, no llevamos a cabo el cribado de la cuarta mutagénesis, y no seleccionamos tres mutaciones UV. Por lo tanto, las cepas mutantes UV1-6, UV2-2 y UV3-10 obtenidas del tercer cribado de mutagénesis UV se seleccionaron para el siguiente ensayo.

 

2.1.3 Resultados de la estabilidad genética

Las cepas mutantes UV 1-6, UV 2-2 y UV 3-10 obtenidas de tres cribados de mutagénesis UV se pasaron sucesivamente durante ocho veces, y se determinó el contenido de glutatión extracelular tras el cultivo de fermentación de la primera generación, la cuarta generación y la octava generación, respectivamente, y los resultados se muestran en la Tabla 1.

El mayor contenido de glutatión extracelular de 18,56 mg/L se encontró en UV 3-10 en la 8ª generación, y el rendimiento de fermentación de UV 3-10 en la producción de glutatión extracelular era genéticamente estable, por lo que UV 3-10 fue seleccionada como cepa objetivo.

 

2.2 Optimización de las condiciones de fermentación

En las condiciones originales de fermentación en matraz agitador, es decir, volumen de llenado del matraz agitador de 100 mL/300 mL, pH inicial natural, temperatura de fermentación de 30 ℃ y velocidad de rotación de 180 r/min, el contenido extracelular de GSH de la cepa mutante fue de 18,56 mg/L y la biomasa de 5,64 g/L. Se llevaron a cabo pruebas de optimización para optimizar el periodo de fermentación, el volumen de llenado del matraz agitador, el pH inicial, la temperatura de fermentación y la velocidad de rotación de la cepa mutante, respectivamente. El ciclo de fermentación, la carga del matraz de agitación, el valor inicial del pH, la temperatura de fermentación y la velocidad de rotación del matraz de agitación se optimizaron mediante la prueba de optimización de un factor. Los efectos del periodo de fermentación en la producción de glutatión extracelular por la cepa UV3-10 se muestran en la Fig. 5.

 

Como se muestra en la Figura 5, el contenido de glutatión extracelular de la cepa mutante aumentó y luego disminuyó con la extensión del tiempo de fermentación. El contenido de glutatión extracelular de la cepa mutante fue de 18,97 mg/L en el tiempo de fermentación de 48 h. El contenido de glutatión extracelular comenzó a disminuir con la ampliación del tiempo de fermentación, por lo que se eligió el tiempo de fermentación de 48 h como tiempo de fermentación, y las demás condiciones de fermentación se optimizaron aún más sobre la base del tiempo de fermentación.

En la Figura 6 se muestra el efecto del volumen de agitación sobre la producción extracelular de glutatión por la cepa objetivo.

 

 A partir de la Fig. 6, se puede observar que el contenido más alto de glutatión extracelular de la cepa objetivo se encontró cuando el volumen de líquido del matraz de agitación fue de 75 mL/300 mL, y a medida que el volumen de líquido del matraz de agitación aumentaba gradualmente, el contenido de glutatión extracelular comenzó a disminuir, y el alto volumen de líquido del matraz de agitación afectó el oxígeno disuelto en el matraz de agitación, afectando así la fermentación de la cepa objetivo, por lo que se seleccionó el volumen de líquido óptimo del matraz de agitación de 75 mL/300 mL.

Los resultados de la optimización del pH inicial del agitador mutante se muestran en la Figura 7.

 

Cuando el valor inicial de pH se incrementó de 5,0 a 6,0, el contenido de glutatión extracelular no cambió mucho, pero cuando el valor de pH se incrementó a 6,5, el contenido de glutatión extracelular aumentó rápidamente a 36,42 mg/L, y luego comenzó a disminuir con el aumento del valor de pH, y alcanzó el valor máximo a pH 6,5. Por lo tanto, se eligió el valor óptimo de pH inicial de 6,5.

En la figura 8 se muestra el efecto de la temperatura de fermentación sobre la producción de glutatión extracelular por la cepa objetivo.

 

 Como se muestra en la Figura 8, la temperatura de fermentación tuvo un mayor efecto sobre el contenido de glutatión extracelular de la cepa objetivo que otros factores, y el aumento de la temperatura de fermentación promovió la secreción de glutatión extracelular por la cepa mutante[31] . El contenido de glutatión extracelular aumentó con el aumento de la temperatura de fermentación, y alcanzó 40,63 mg/L a 34 ℃, que era 1,68 veces mayor que a 30 ℃. Cuando la temperatura de fermentación se incrementó a 34 ℃, el contenido de glutatión extracelular alcanzó 40,63 mg / L, que era 1,68 veces de la temperatura de fermentación de 30 ℃. Cuando la temperatura de fermentación se incrementó a 42 ℃, el contenido de glutatión extracelular de la cepa mutante alcanzó 17,15 mg / L, y la biomasa de la cepa mutante se redujo al nivel más bajo, que fue de 3,16 g / L. Por lo tanto, la temperatura óptima de fermentación fue seleccionado para ser 34 ℃.

En la Figura 9 se muestra el efecto de la velocidad del matraz agitador sobre la producción de glutatión extracelular por la cepa objetivo.

 

La cantidad de oxígeno disuelto en el matraz de agitación se vio afectada por la cantidad de líquido cargado en el matraz y la velocidad de rotación, la fuerza de cizallamiento generada por la velocidad de rotación del matraz, la tasa de transferencia de masa, y la cantidad de líquido cargado en el matraz tuvieron un efecto sobre la cantidad de inóculo, el estado de crecimiento, y la síntesis y acumulación de los productos de fermentación de las cepas, que se puede ver en la Fig. 9, el contenido de glutatión extracelular fue el más alto cuando la velocidad de rotación del matraz de agitación fue de 140 r/min, y el contenido de glutatión extracelular de la cepa objetivo fue de 52,05 mg/L, 2,80 veces del contenido de glutatión extracelular de la cepa objetivo antes de la optimización. El contenido de glutatión extracelular de la cepa objetivo fue de 52,05 mg/L, 2,80 veces superior al de antes de la optimización.

 

Tras la optimización de la fermentación en matraz agitador, el contenido extracelular de GSH de la cepa mutante alcanzó 52,05 mg/L tras 48 h de fermentación, que era 2,80 veces superior al de la fermentación preoptimizada, con el volumen de llenado del matraz agitador de 75 mL/300 mL, el valor inicial de pH de la fermentación de 6,5, la temperatura de fermentación de 34 ℃ y la velocidad de rotación de 140 r/min.

 

3. Debate y conclusiones

En este estudio, se analizó la cepa mutante UV3-10 para la producción de GSH extracelular mediante mutagénesis UV iterativa, y su contenido de GSH extracelular fue de 18,56 mg/L. Las condiciones óptimas para la fermentación en matraz de agitación se obtuvieron mediante una prueba unidireccional, que incluía un periodo de fermentación de 48 h, un volumen de carga de 75 mL/300 mL, un valor inicial de pH de 6,5, una temperatura de fermentación de 34 ℃, y una velocidad de rotación de 140 r/min. Tras la optimización, el contenido extracelular de GSH de la cepa mutante fue de 52,05 mg/L, 2,80 veces superior al de antes de la optimización.

 

El mecanismo de secreción extracelular de la cepa mutante UV3-10 se propuso como sigue: la permeabilidad celular de la cepa mutante se alteró tras la mutagénesis, es decir, la actividad de algunas proteínas exportadoras de GSH se reforzó o la actividad de algunas proteínas degradadoras de GSH se inhibió tras la mutagénesis, por lo que las sustancias intracelulares de las células de levadura se desbordaron específicamente a la zona extracelular, y se generó la acumulación de GSH extracelular en las condiciones normales de fermentación. La relación entre las actividades de las proteínas transportadoras de glutatión y del sistema GSH sintetasa de las cepas mutantes y su mecanismo de secreción extracelular puede investigarse en estudios posteriores, y cómo mantener la estabilidad del GSH extracelular en las fases posteriores de la fermentación es también una cuestión a investigar.

 

La cepa mutante UV3-10 puede secretar GSH sintetizado intracelularmente a extracelular, realizando así la acumulación efectiva de GSH extracelular, lo que mejora enormemente la posibilidad de preparación industrial de GSH en caldo de fermentación, y reduce la dificultad de purificación y aislamiento en comparación con la extracción de GSH intracelular, ahorrando así costes de producción y consumo de energía. Además, Saccharomyces cerevisiae es una cepa de seguridad alimentaria, muy favorecida por los desarrolladores de alimentos, y los resultados del estudio sobre la producción de GSH extracelular por fermentación de Saccharomyces cerevisiae proporcionan nuevas perspectivas y beneficios económicos para su aplicación en el procesado, almacenamiento y conservación de alimentos, y aromas funcionales.

 

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