Resumen：Se utilizó luz ultravioleta y nitrosoguanidina para mutagenizar la cepa de partida SIPI-G0619, mientras que tres pantallas de resistencia, etionina, cloruro de zinc y triazol, se utilizaron como modelos de selección, y finalmente se obtuvo una cepa estable de alto rendimiento de glutatión, SIPI-Gh435; el rendimiento de glutatión fue de 864 mg/L, que es 4,9 veces mayor que el de la cepa de partida.
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El glutatión (1), un tripéptido formado por la condensación de ácido glutámico, cisteína y glicina, es uno de los principales antioxidantes de los organismos vivos y desempeña un papel clave en el mantenimiento de un entorno redox adecuado[1] . Los grupos sulfhidrilos de las moléculas de glutatión pueden unirse competitivamente a los óxidos, protegiendo así los grupos sulfhidrilos de las proteínas funcionales de los organismos; y pueden unirse a iones de metales pesados, como Pb2+ y As3+, para evitar la desnaturalización de las proteínas[2] y desempeñar una función desintoxicante. Al mismo tiempo, también tiene efectos antirradiación y antienvejecimiento [3,4].
El glutatión puede producirse por extracción, síntesis química y fermentación, entre los cuales la fermentación es el principal método de producción [5]. Sin embargo, el nivel de fermentación de 1 en China no es lo suficientemente alto para la producción industrial. Por lo tanto, es especialmente importante obtener una cepa de alto rendimiento de 1 y lograr la industrialización lo antes posible. En este estudio, utilizamos luz ultravioleta y nitrosoguanidina para mutar la cepa de partida SIPI-G0619 y, al mismo tiempo, utilizamos etionina, cloruro de zinc y triazol como modelos de cribado, y finalmente, obtuvimos la cepa de 1 de alto rendimiento genéticamente estable SIPI-Gh435, con una potencia de fermentación de 864 mg/L, que es 4,9 veces superior a la de la cepa de partida.
1 Instrumentos y materiales
1.1 Instrumentos y reactivos
Cromatógrafo de líquidos de alta resolución modelo 2 9 9 6 (Water s Company); centrifugadora Allegra TM X-22R (rotor F0850) (Beckman coulter).
Etionina (Sigma); todos los demás reactivos eran de pureza analítica doméstica.
1.2 Cepa y medio
Cepa de partida: Levadura productora de priones (Candida u til is) SIPI-G0619 (en nuestra colección).
Medio de cultivo y de placa/g-L-1 : extracto de levadura 3,0, glucosa 20, peptona 15, agar 22; pH natural.
Medio matraz de siembra/g-L-1 : glucosa 20, extracto de levadura 10, peptona 10; 20 ml/250 ml; pH 5,5.
Medio de fermentación/g - L-1 : glucosa 40, extracto de levadura 2,0, (NH4)2SO4 12, K2SO4 3,0, MgSO4-7H2O 1,0, MnSO4-H2O 0,01, FeSO4-7H2O 0,01; pH 5,5; carga 30ml/250ml.
2 Metodología y resultados
2.1 Métodos de cultivo y determinación del contenido
Método de cultivo de semillas: Recoger un anillo de organismos del slant activado en el medio de siembra, e incubar a 30℃ con oscilación (220r/min) durante 24h.
Método de cultivo por fermentación: Las semillas se cultivaron durante 24h, y se añadió un 5% del inóculo al medio de fermentación, y se cultivó a 30℃ con oscilación (220r/min) durante 32h.
Determinación del contenido: 1 para el producto intracelular. El caldo de fermentación se centrifugó (10000r/min) durante 4min, y la bacteria resultante se extrajo con ácido sulfúrico al 2% durante 2h . El contenido de 1 se determinó por HPLC [6].
2.2 Métodos de mutagénesis
Mutagénesis UV: La suspensión bacteriana de la cepa de partida SIPI-G0619 se irradió con luz UV (30W, 30cm de distancia, 33r/min) durante un cierto periodo de tiempo y luego se extendió sobre el medio en placa para calcular el número de organismos viables y la tasa letal (Tabla 1).
Mutagénesis con nitrosoguanidina (NTG): En condiciones asépticas, añada 0,1 ml de NTG 50mg/ml a un tubo de centrífuga que contenga 5,0 ml de suspensión bacteriana, y colóquelo en un agitador a 28℃. Centrifugar (10.000r/min) durante 10min, y lavar los organismos precipitados con solución salina al 0,85% durante 3 veces, luego hacer la suspensión bacteriana conteniendo solución salina, y esparcirla en el medio de la placa para calcular el número de organismos viables y la letalidad (Tabla 1).
Tabla 1 Letalidad de las cepas tras la irradiación UV y el tratamiento con NTG a diferentes tiempos
mutágeno | Tiempo/min | Número de bacterias vivas/pc-ml-1 | Tasa de letalidad/por ciento |
UV | 0 | 3.0 x 106 |
|
0.25 | 1.6 x 106 | 47 | |
0.5 | 6.0 x 104 | 98 | |
0.75 | 7.0 x 102 | >99 | |
Función del GNT | 0 | 6.0 x 106 | — |
30 | 2.5 x 106 | 58 | |
50 | 6.0 x 104 | 99 | |
80 | 4.0 x 102 | >99 |
Basándose en la experiencia, se eligieron 3 0 s de acción como condición de mutagénesis UV y 50 min de acción como condición de mutagénesis NTG.
2.3 Métodos de selección
2.3.1 Letalidad de los cribas de resistencia contra la cepa de partida
Etionina: es un análogo estructural de 1 y puede inhibir por retroalimentación la biosíntesis de 1. Cuando se aumenta la concentración de etionina, la tasa de mortalidad del organismo aumenta debido a la falta de 1 (Tabla 2).
Cloruro de zinc: Las concentraciones intracelulares elevadas de Zn2+ pueden deformar e inactivar el centro activo de la glutatión reductasa [7], inhibiendo así la síntesis de glutatión reducido.El Zn2+ es un oligoelemento esencial para el crecimiento de la levadura, y también es un ion de metal pesado, que puede promover el crecimiento de la levadura a una concentración baja, pero inhibir la actividad de muchas enzimas a una concentración elevada, dando lugar a un aumento de la tasa de mortalidad de la levadura (Tabla 2).
1,2,4-Triazol: Según la bibliografía [8], las cepas mutantes resistentes al triazol tienen una elevada capacidad para sintetizar 1. Sin embargo, altas concentraciones de triazol tuvieron un efecto inhibidor sobre el crecimiento celular y la mortalidad de las levaduras aumentó con el incremento de las concentraciones de triazol (Tabla 2).
Tabla 2 Letalidad de las cepas con diferentes concentraciones de etionina, cloruro de zinc y triazol.
pantalla de resistencia | Concentración/mg-ml-1 | 6Bacterias viables/10 -ml-1 | Tasa de letalidad/por ciento |
etionina (ET), un aminoácido esencial | 0 | 5.2 | — |
0.06 | 4.3 | 17 | |
0.1 | 3.3 | 37 | |
0.3 | 1.3 | 75 | |
cloruro de zinc | 0 | 5.2 |
|
0.5 | 3.4 | 35 | |
1.0 | 1.8 | 65 | |
2.0 | 0.19 | 96 | |
triazol (química) | 0 | 5.2 | — |
0.1 | 4.7 | 9.6 | |
0.5 | 3.9 | 25 | |
1.0 | 0.3 | 42 |
La letalidad (tasa de inhibición) de la mezcla de cribado de resistencia a la cepa de partida fue del 7,8% cuando la mezcla contenía 0,1mg/ml de etionina, 1,0mg/ml de cloruro de zinc y 0,5mg/ml de triazol; y del 95% cuando la mezcla contenía 0,3mg/ml de etionina, 2,0mg/ml de cloruro de zinc y 1,0mg/ml de triazol. Cuando la mezcla de cribado contenía 0,3mg/ml de etionina, 2,0mg/ml de cloruro de zinc y 1,0mg/ml de triazol, la letalidad (inhibición) de la cepa de partida era del 95%.
2.3.2 Establecimiento de un modelo de cribado de cepas de alto rendimiento y cribado
La mayoría de las cepas mutantes murieron debido a la inhibición de 1 síntesis cuando se aplicaron a placas que contenían tres pantallas de resistencia: etionina, cloruro de zinc y triazol. Sólo las cepas mutantes con la inhibición arriba indicada pudieron crecer en placas que contenían altas concentraciones de las pantallas de resistencia, y probablemente fueron las cepas más productivas.
2.3.2.1 Cribado por mutagénesis UV
La cepa de partida SIPI-G0619 se irradió con luz UV durante 30 segundos. La solución bacteriana mutagenizada se extendió sobre una placa de cribado que contenía etionina 0,1mg/ml, cloruro de zinc 1,0mg/ml y triazol 0,5mg/ml, y se incubó a 28℃ durante 2d.
Se recogieron un total de 620 colonias individuales para pasar el slant y se tamizaron por lotes. La potencia de fermentación de la cepa de partida fue de 176,3 mg/L, de los cuales la potencia de fermentación fue 1,2 veces superior a la de la cepa de partida. La potencia de fermentación fue de 176,3 mg/L, de los cuales la potencia de fermentación fue más de 1,2 veces superior a la de la cepa de partida, lo que representa más del 60%. Se seleccionaron un total de 18 cepas con un rendimiento de 2,3 veces o más que el de la cepa de partida. Tras el cribado, se obtuvo una cepa de alto rendimiento, SIPI-Gr232, con una potencia de fermentación de 475 mg/L, 2,7 veces superior a la de SIPI-G0619. Esta cepa se utilizó como cepa de partida para el siguiente paso de la mutagénesis NTG.
2.3.2.2 Cribado de mutagénesis NTG
La cepa SIP I -Gr 2 3 2 se trató con NT G durante 5 0 min. La solución bacteriana mutagenizada se extendió en placas de cribado que contenían etionina 0 . 3 mg/ml, cloruro de zinc 2,0 mg/ml y triazol 1,0 mg/ml.
Se recogieron 530 colonias individuales para pasar el slant y se tamizaron por lotes. Más del 45% de las cepas tenían una eficacia de fermentación superior a 1,2 veces la de SIPI-Gr232. La eficiencia de fermentación de SIPI-Gh435 fue de 864mg/L, lo que fue 1,8 veces la de SIPI-Gr232 y 4,9 veces la de SIPI-G0619.
2.4 Examen de la estabilidad de la cepa mutante de alto rendimiento SIPI-Gh435
La capacidad de producción de SIPI-Gh435 disminuyó ligeramente del 100% al 94% tras 4 generaciones consecutivas, y se redujo al 83% y al 72% tras F5 y F6. Esto indica que la cepa SIPI-Gh435 es genéticamente estable.
3 Debate
En [9], se obtuvo una cepa mutante resistente de 1 mediante mutagénesis UV y cribado para la resistencia a la etionina, con un rendimiento de 180 mg/L. En [10], se obtuvo una cepa de alto rendimiento de 1 mediante mutagénesis UV y nitrosoguanidina y cribado para la resistencia a la etionina y al triazol, con un rendimiento de 339,1 mg/L. Sin embargo, aún no se ha informado del método de adición de las tres resistencias, a saber, etionina, cloruro de zinc y triazol, a la placa de cribado como condiciones de cribado. Sin embargo, no se ha informado de la adición simultánea de etionina y cloruro de zinc y triazol a la placa de cribado como condición de cribado. Utilizando este modelo, se obtuvo un mutante de resistencia estable de alto rendimiento de 1, SIP I - Gh435, con un rendimiento de 864 mg/L, muy superior al rendimiento de 1 del informe anterior.
Referencias:
[1] Demopoulos HB, Seligman ML. Preparaciones farmacéuticas de glutatión y métodos de administración de las mismas: US, 6586404 [P]. 2003-07-01.
[2] Grant CM . Papel de los sistemas glutatión/glutaredoxina y tiorredoxina en el crecimiento de la levadura y la respuesta a condiciones de estrés[J]. Mol Microbiol, 2001, 39(3): 533-541.
[3] Cha JY, Park TC, Jeon BS, et al. Optimal fermentation conditions for enhanced glut athi one production by Saccharomyces cerevisiae FF-8[J]. J Microbiol, 2004, 42(1): 51-55.
[4] Sun Hong-Gang, Lu Yi-Zhen. Metabolismo y aplicación del glutatión[J]. Health Career Education, 2004, 22(10):126.
[5] ZHOU Yuguang, FU Guoping, XIAO Zaijun. Progress in the production and application of glutathione [J]. Ciencia y tecnología de la industria alimentaria, 2003, 24(3): 89-91.
[6] ZHANG Lirong, WANG Zhigang, XIE Qingjiao. Determinación de glutatión reducido para inyección por HPLC[J]. Qilu Pharmaceutical Affairs, 2005, 24(2): 93-94.
[7] JIA Jianping, QIU Juanping. Selection and breeding of high glutathione producing strains[J]. Microbiology Circular, 2003, 30(4): 24-29.
[8] Hamada S, Tanaka H, Sakato K. Proceso para producir glutatión: US, 4582801 [P]. 1986-04-15.
[9] HU Linhua, TAN Tianwei. Selección de cepas de levadura de glutatión de alto rendimiento y estudio preliminar de las condiciones de cultivo[J]. Journal of Chemical Engineering in Higher Education, 2005, 19(2): 273-276.
[10] TONG Qunyi, CHEN Jian, LI Huazhong. Selection of yeast for high glutathione production and their culture conditions[J]. Microbiología industrial, 2002, 32(2): 13-17.
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