¿Cómo detectar electroquímicamente el glutatión reducido?

 El glutatión está presente en todos los tejidos de mamíferos en concentraciones que oscilan entre 1 y 10 mM, y es un tripéptido unido a γ-amida formado por cisteína (Cys), glutamato (Glu) y glicina (Gly). El glutatión existe normalmente en el organismo en forma de glutatión reducido (GSH) y su forma oxidada (L-glutatión oxidado (GSSG)) (véase la Fig. 1 para la estructura), que se transforman entre sí en el organismo y alcanzan un equilibrio dinámico, manteniendo así el equilibrio redox en el organismo [1-2]. Los cambios en la concentración de GSH están estrechamente relacionados con el desarrollo de ciertas enfermedades en organismos y tejidos, y su concentración puede utilizarse como indicador de diversas enfermedades como la leucemia, la enfermedad de Alzheimer, el SIDA, el carcinoma celular, la diabetes y la aterosclerosis[3-5] . Por lo tanto, los investigadores se han comprometido con el desarrollo de ensayos sensibles y selectivos para monitorizar la dinámica del GSH en los organismos, con el fin de comprender los mecanismos químicos de la patogénesis de diversas enfermedades a nivel molecular, y proporcionar métodos y herramientas para el diagnóstico clínico y la terapia dirigida.

 

Hasta ahora, los principales métodos utilizados para la determinación del glutatión incluyen la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la electroforesis capilar (CE), el análisis óptico y los métodos electroquímicos[6-9] . Los métodos electroquímicos se han utilizado durante mucho tiempo en el análisis de GSH debido a la sencillez de su equipamiento, su bajo coste y la miniaturización e integración de los electrodos, que pueden convertirse en dispositivos portátiles para análisis in situ e in vivo. En este artículo, revisamos los nuevos avances en los métodos de detección de GSH basados en técnicas electroquímicas de los que se ha informado en las últimas décadas, y ofrecemos una perspectiva de las futuras tendencias de investigación.

 

1 Principio de la detección electroquímica de GSH

La detección electroquímica hace uso de los principios básicos de las reacciones electroquímicas para generar señales eléctricas (por ejemplo, resistencia, conductividad, potencial, corriente, etc.) relacionadas con la concentración del analito objetivo para lograr la detección cualitativa y el análisis cuantitativo de la molécula objetivo. Las técnicas de detección electroquímica más comunes incluyen la voltamperometría cíclica (CV), la espectroscopia de impedancia electroquímica, la amperometría, la cronoamperometría, la voltamperometría diferencial de impulsos (DPV) y la voltamperometría de onda cuadrada (SWV). La propia GSH es electroquímicamente activa, es decir, puede transferir electrones con la superficie del electrodo y, por lo tanto, la GSH puede detectarse mediante métodos electroquímicos. La detección electroquímica de GSH puede dividirse en métodos directos e indirectos. El método directo se basa en la transferencia directa de electrones entre GSH y el electrodo para detectar cuantitativamente GSH. El principio es que GSH es una sustancia reductora con grupos sulfhidrilo, y a un determinado potencial, puede oxidarse en la superficie del electrodo por la pérdida de dos electrones y dos protones, lo que da lugar a la corriente oxidativa (como se muestra en la Fig. 1), y entonces se genera una corriente oxidativa. La corriente de oxidación puede cuantificarse basándose en la corriente oxidativa generada para detectar GSH.

 

El método indirecto consiste en cuantificar GSH indirectamente basándose en las señales eléctricas de otras sustancias químicas. El mediador de electrones tiene una buena actividad electroquímica, y el principio del método de detección indirecta de GSH basado en el mediador de electrones se muestra en la Figura 1[10]. El mediador de electrones M genera primero el mediador de electrones oxidado Mox por transferencia de electrones en la superficie del electrodo, y luego se produce la reacción de oxidación entre Mox y GSH, que oxida el GSH a GSSG, y el Mox se reduce a la forma reducida del mediador de electrones Mred, y la cuantificación final de GSH puede hacerse indirectamente basándose en el pico de oxidación generado por Mred en la superficie del electrodo. El pico de oxidación generado por Mred en la superficie del electrodo se utilizó para cuantificar GSH indirectamente. Los investigadores pueden elegir diferentes mediadores de electrones en función de las propiedades químicas y electroquímicas del GSH para mejorar la sensibilidad y selectividad de la detección.

 

Además de la detección electroquímica indirecta de GSH basada en mediadores de electrones, se han descrito muchos métodos electroquímicos para la detección de GSH basados en la fuerte afinidad de GSH por varios iones metálicos o nanomateriales metálicos [11-13]. GSH tiene un grupo sulfhidrilo-SH, que tiene una fuerte afinidad por Cu2+, Ag+, Hg2+, Pb2+, Co+, y nanomateriales de Au, Ag, Cu, y estos iones metálicos como Cu2+, Ag+, Hg2+, y Pb2+ son electroquímicamente activos. Estos iones metálicos como Cu2+, Ag+, Hg2+, Pb2+ son electroquímicamente activos, cuando se añade GSH al sistema de reacción, el GSH puede unirse a estos iones metálicos o nanomateriales metálicos y hacer que sus señales electroquímicas cambien regularmente con diferentes grados, para cuantificar el GSH indirectamente en base a las señales electroquímicas cambiadas.

En conclusión, la detección electroquímica directa de GSH se basa en la señal electroquímica del propio GSH para cuantificar GSH, mientras que la detección electroquímica indirecta de GSH se basa en las señales electroquímicas de otras sustancias para cuantificar GSH.

 

2 Electrodos de sustrato

Los electrodos de sustrato que pueden utilizarse para detectar GSH incluyen electrodos de carbono vítreo, electrodos de oro, electrodos de mercurio, electrodos de pasta de carbono y electrodos de platino. Los sensores electroquímicos de glutatión basados en electrodos de mercurio detectan GSH basándose en la oxidación del mercurio en la superficie para formar un complejo mercurio-tiol. Este comportamiento electroquímico se produce a un potencial de +0,1 V. El bajo potencial de oxidación permite la detección de GSH sin interferencias de otras sustancias fisiológicamente activas como otros aminoácidos, glucosa, ácido ascórbico y ácido úrico. Sin embargo, los electrodos de mercurio son tóxicos y la respuesta electroquímica al GSH se ralentiza al aumentar el tiempo de detección, y el comportamiento electroquímico es inestable y poco reproducible.

 

Una situación similar se da en otros electrodos metálicos como los de oro y platino. Los óxidos superficiales que se forman en los electrodos de trabajo de platino y oro favorecen la oxidación del GSH, sin embargo, los depósitos de sulfuro en la superficie de los electrodos metálicos pasivan los electrodos, ralentizando la transferencia de electrones a medida que aumenta el tiempo de detección e incrementando los sobrepotenciales, lo que complica mucho la aplicación analítica. Los electrodos basados en carbono también se han utilizado muchas veces para la detección de GSH. Por ejemplo, el electrodo de carbono vítreo GC tiene una amplia gama de potenciales de trabajo, y su gran inercia química proporciona un alto grado de precisión en la detección, lo que hace que se utilice ampliamente en análisis electroquímicos. Sin embargo, en el electrodo GC, el GSH se oxida a GSSG sólo a un potencial de aproximadamente +1,0 V. Un potencial de oxidación tan alto indica que el GSH tiene una baja tasa de transferencia de electrones en el electrodo GC, tiene un gran sobrepotencial y es susceptible a la interferencia de otras sustancias fisiológicamente activas, que son las desventajas que limitan el uso directo del electrodo GC desnudo para la detección de GSH. Con el fin de acelerar la tasa de transferencia de electrones de GSH en la superficie del electrodo, reducir el sobrepotencial y evitar la pasivación del electrodo durante el proceso de detección, la modificación de nanomateriales y mediadores de electrones en la superficie del electrodo de sustrato se ha aplicado en muchas ocasiones al diseño de sensores electroquímicos de GSH. La modificación de nanomateriales y mediadores de electrones en la superficie del electrodo de sustrato se ha aplicado en numerosas ocasiones al diseño de sensores electroquímicos de GSH. Mediante la modificación de nanomateriales en la superficie del electrodo y la inmovilización de diversos tipos de activadores de la reducción oxidativa, se puede acelerar la velocidad de transferencia de electrones entre el GSH y el electrodo, reducir el sobrepotencial y mejorar la sensibilidad y la selectividad.

 

3 Aplicación de nanomateriales en la detección electroquímica de GSH

Debido a la baja sensibilidad, la escasa reproducibilidad, la lenta transferencia de electrones y el elevado sobrepotencial de los electrodos desnudos para la detección electroquímica, la modificación de los electrodos ha cobrado gran importancia.En el siglo XXI, el rápido desarrollo de la nanotecnología ha aportado nuevas aportaciones a la química electroanalítica. Los nanomateriales son moléculas con un tamaño de entre 1 y 100 nm, lo que les confiere propiedades únicas como el efecto de interfaz superficial, el efecto cuántico de tamaño y el efecto cuántico de túnel. Mediante la modificación de diversos nanomateriales en la superficie del electrodo de trabajo, se puede obtener una interfaz de detección estable, selectiva y sensible, mejorando así el rendimiento analítico. Debido al excelente rendimiento de los nanomateriales, se ha promovido el desarrollo de nanomateriales en el campo de la investigación electroquímica, y también se ha ampliado la detección electroquímica de sustancias poco activas. Por ejemplo, se han utilizado nanomateriales metálicos, como nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, clústeres de oro, clústeres de cobre, nanotubos de carbono y nanomateriales de grafeno, en la detección electroquímica de GSH.

 

Los nanotubos de carbono, incluidos los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs) y los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs), con buenas propiedades conductoras y alta superficie específica, se han aplicado a la detección de GSH en muchas ocasiones. La modificación de los nanotubos de carbono en el electrodo de sustrato puede acelerar la transferencia de electrones entre el GSH y la superficie del electrodo y reducir en gran medida el sobrepotencial. Por ejemplo, el potencial de pico de oxidación de GSH en el electrodo SWCNTs/GC se sitúa en +0,55 V, que es 0,45 V inferior al del electrodo GC desnudo en +1,0 V. El electrodo GC modificado con SWCNTs puede utilizarse para la detección múltiple de GSH, y la sensibilidad de detección no disminuirá debido a la pasivación del electrodo por la contaminación.

 

Gong et al.[14] utilizaron MWCNTs dopados en gel de silicato para preparar electrodos compuestos de cerámica y nanotubos de carbono (CCNNEs) para la determinación de GSH. Los comportamientos electroquímicos de los electrodos preparados mediante esta técnica sol-gel son sintonizables en función de la cantidad de MWCNTs dispersos en el gel de sílice, y los electrodos presentan voltamperogramas cíclicos de electrodos de tamaño convencional cuando están dopados con un alto contenido de MWCNTs (superior a 1,5 mg/mL); y los electrodos presentan voltamperogramas cíclicos de electrodos de tamaño normal cuando están modificados con un bajo contenido de MWCNTs (inferior a 0,1 mg/mL). Cuando se dopó con un alto contenido de MWCNTs (superior a 1,5 mg/mL), la modificación del material en la superficie de los electrodos GC dio lugar a que los electrodos exhibieran voltamperogramas cíclicos de electrodos de tamaño convencional; cuando se dopó con un bajo contenido de MWCNTs (inferior a 0,1 mg/mL), el material dio lugar a que los electrodos exhibieran voltamperogramas cíclicos de microelectrodos, y el material tuvo un efecto electrocatalítico significativo en la oxidación de GSH. El grafeno (GR), incluyendo el grafeno reducido (rGO) y el grafeno oxidado (GO), es también un tipo de material de carbono con buenas propiedades catalíticas electroquímicas, y se ha aplicado muchas veces a la detección electroquímica de GSH. Yuan et al. [15] compararon los comportamientos electroquímicos de GSH en electrodos de GO/GC obtenidos por reducción a diferentes potenciales de reducción, y los resultados mostraron que el GO reducido a -0,75 V tenía el mejor efecto electrocatalítico sobre la oxidación de GSH. Los resultados mostraron que el GO reducido a un potencial de -0,75 V tenía el mejor efecto electrocatalítico sobre la oxidación del GSH, y la oxidación del GSH podía producirse a +0,3 V. Atribuyeron el efecto electrocatalítico a los grupos carboxilo y carbonilo del borde del GO.

 

Con el fin de reducir aún más el límite de detección, se han utilizado ampliamente diversos nanomateriales metálicos, como oro, plata, cobre, níquel, aluminio y platino, para modificar la superficie de los electrodos para la detección electroquímica de GSH.Dong et al.[16] utilizaron un electrodo GC (Ni-Al DHs/ GCE) basado en la co-modificación de MWCNTs e hidroxilos bis-hidroxilados de níquel y aluminio electrodepositados (Ni-Al LDHs) como electrodo de trabajo. MWCNTs/GCE) como electrodo de trabajo. Los resultados experimentales demostraron que, combinando Ni-AlLDHs y MWCNTs, la corriente de respuesta de GSH en Ni-Al LDHs/MWCNTs/GCE era significativamente mayor que en MWCNTs/GCE y Ni-Al LDHs/GCE, y el pico potencial se desplazaba al polo negativo, y la corriente anódica era más de diez veces la de Ni-Al LDHs/GCE, con un límite de detección de hasta 0,7 μM, lo que demostraba que la combinación de Ni-Al LDHs y MWCNTs podía utilizarse como electrodo de trabajo. Stojanovi et al. [17] utilizaron un electrodo de pasta de carbono (CPE) modificado con Sb2 O3(trióxido de antimonio) como electrodo de trabajo para detectar tanto GSH como GSSG, y el límite de detección de GSH y GSSG fue de 0,7 μM, lo que indicaba que la combinación de Ni-Al LDHs y MWCNTs tenía un buen efecto electrocatalítico sobre GSH y mejoraba enormemente la sensibilidad de la detección. Los límites de detección de GSH y GSSG fueron de 0,34 μM y 0,10 μM para GSH y GSSG, respectivamente. Para la detección de GSH también se han utilizado otros nanomateriales como Pd, IrO2, TiO2, Cu, Pt, Au, MnO2, etc. [21-24], nanomateriales y nanoclusters en diversas formas, y electrodos modificados con compuestos de marco metalorgánico [11].

 

En conclusión, el electrodo de sustrato modificado por nanomateriales puede reducir el sobrepotencial, aumentar la sensibilidad y disminuir el límite de detección. Con el desarrollo de la ciencia de materiales, se utilizan más nanomateriales para modificar el electrodo de sustrato con el fin de mejorar la sensibilidad de detección, pero la adición de materiales modificadores puede mejorar la sensibilidad tanto del objeto de ensayo como de los interferentes, pero la selectividad para el objeto de ensayo sigue siendo baja.

 

4 Aplicación de mediadores de electrones en la detección electroquímica de GSH

Además de los nanomateriales, a menudo se modifican los mediadores de electrones en la superficie de los electrodos para aumentar la sensibilidad de detección y mejorar la selectividad del método. Los mediadores de electrones suelen tener un peso molecular pequeño y transfieren electrones entre el material que se va a medir y el electrodo, lo que hace que el material sea más susceptible al redox en la superficie del electrodo. Dependiendo de las propiedades químicas y electroquímicas del material a medir, pueden seleccionarse diferentes mediadores de electrones.

 

En términos generales, al seleccionar un mediador de electrones, en primer lugar, la sustancia seleccionada debe tener una buena actividad electroquímica, es decir, debe transferir electrones a la superficie del electrodo a una velocidad rápida; y en segundo lugar, debe tener un buen efecto electrocatalítico sobre la sustancia sometida a prueba. Los mediadores de electrones reportados para la detección electroquímica de GSH incluyen ferroceno, complejos de metaloporfirina, derivados metálicos de bipiridina, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, acetilamino además de catecoles y sus derivados, y también hay otros mediadores de electrones para la detección de GSH.Yuan et al.[20] reportaron un mediador de electrones basado en una combinación de 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano (TCNQ) y quinolinas que contienen cátodo. Yuan et al.[20] informaron de un electrodo de carbono vítreo basado en 7 ,7 ,8 ,8-tetracianoquinolinedimetano (TCNQ) y electrodo de carbono vítreo modificado con rGO de grafeno para la detección de GSH, con TCNQ como mediador de electrones y rGO/GC como electrodo de trabajo. El electrodo de carbono vítreo modificado con TCNQ/rGO fue capaz de detectar GSH a -50 mV, lo que redujo el sobrepotencial de oxigenación de GSH, y tuvo un amplio rango lineal y un bajo límite de detección, y se ha aplicado con éxito a la determinación de GSH en gotas para los ojos.

En conclusión, la conductividad superior y la capacidad electrocatalítica de los nuevos nanomateriales pueden aumentar la sensibilidad de la detección; mientras que la selección de mediadores de electrones adecuados puede mejorar la selectividad de la detección electroquímica de GSH, por lo que existen varios informes sobre la combinación de nanomateriales y mediadores de electrones para la detección de GSH.

 

5 Conclusiones

Catecol, catecol y sus derivados (incluyendo catecol, dopamina, ácido cafeico, norepinefrina, etc.), etc.[18-24] . El catecol y sus derivados se han utilizado durante mucho tiempo como mediadores de electrones de tioles reducidos, incluido el GSH, y a partir del resumen de varios estudios se pueden concluir los dos mecanismos de reacción siguientes: el primero es un mecanismo de reacción de oxidación catalizado electroquímicamente (como se muestra en la Fig. 3A). En este mecanismo, el catecol y sus derivados sólo actúan como mediadores de electrones para catalizar la oxidación electroquímica de tioles reducidos de moléculas pequeñas en la superficie del electrodo, mostrando así un voltamperograma cíclico con un aumento del pico de oxidación catalizada y una disminución del pico de reducción. El segundo es el mecanismo de reacción ECE[22] (mostrado en la Figura 3B), es decir, el mediador de electrones catecol y sus derivados A primero se oxidaron electroquímicamente en la superficie del electrodo para producir o-benzoquinona B. El grupo sulfhidrilo de la pequeña molécula reducida mercaptano, SH, tiene una fuerte nucleofilia, y por lo tanto atacó a la o-benzoquinona B en una reacción de sustitución nucleofílica, dando lugar al producto C sustituido por sulfhidrilo. La oxidación electroquímica posterior de C en la superficie del electrodo produjo D, que podría aceptar los picos de oxidación y disminuir los picos de reducción. D puede ser atacado posteriormente por -SH de mercaptano de molécula pequeña reducida para producir E; E puede ser oxidado electroquímicamente en la superficie del electrodo para producir F.

 

El potencial de oxidación electroquímica de los productos mono- y dimercapto-sustituidos C y E es diferente del del mediador de electrones catecol y su derivado A, es decir, se puede encontrar un nuevo pico en el voltamperograma cíclico, y los tioles prototípicos reducidos se pueden cuantificar basándose en los valores actuales de los nuevos picos.McCarley et al. sugirieron que el GSH experimenta el segundo mecanismo de reacción ECE, mientras que la cisteína y la homocisteína, que tienen una estructura similar al GSH, generalmente experimentan el primer mecanismo de reacción, por lo que muchos informes han basado la cuantificación del GSH en la reacción del GSH con el catecol y su derivado para producir nuevos picos. McCarley et al. sugirieron que el GSH experimenta el segundo mecanismo de reacción ECE, mientras que la cisteína y la homocisteína, que son similares en estructura al GSH, generalmente experimentan el primer mecanismo de reacción. En nuestro grupo[23] , el GSH se cuantificó indirectamente basándose en la formación del producto de sustitución catecol-GSH y en el pico de oxidación del producto. El nuevo pico se situó en -0,16 V, que era más negativo que el potencial del pico de oxidación de 0,60 V para el GSH y de 0,20 V para el o-fenol, y otros tioles y otras sustancias fisiológicamente activas apenas interfirieron en la detección del GSH en un determinado intervalo de concentración a este potencial. Este trabajo proporciona un método altamente selectivo para la detección de GSH. Este trabajo proporciona un ensayo altamente selectivo de GSH para la determinación de la fuga intracelular de GSH tras la apoptosis inducida por adriamicina en células HeLa.

 

En vista de las importantes funciones fisiológicas y patológicas del glutatión reducido GSH, es esencial una determinación precisa y rápida del GSH en los organismos. En este trabajo se analizaron en profundidad los principios, ventajas e inconvenientes de los métodos de determinación de GSH desarrollados a partir de técnicas electroquímicas en lo que respecta al electrodo de sustrato, los nanomateriales y los mediadores de electrones. La sensibilidad y selectividad del método se mejoraron seleccionando el electrodo de sustrato y combinándolo con nanomateriales y mediadores de electrones.

 

Teniendo en cuenta la demanda de la química analítica actual, los métodos electroquímicos establecidos aún deben aplicarse a las pruebas clínicas y los análisis de campo, por lo que la miniaturización de los electrodos y el desarrollo de electrodos de prueba desechables son la tendencia de desarrollo futura. Sin embargo, los problemas son los siguientes: para el desarrollo de microelectrodos y electrodos desechables de bajo coste, no se podrán aplicar métodos de modificación demasiado complicados en la superficie del electrodo; se abandonarán los materiales y métodos de modificación demasiado caros; además, los métodos electroquímicos establecidos deben transferirse de los electrodos convencionales a los microelectrodos y electrodos desechables, y la modificación de los electrodos se complicará; incluso si se utiliza el mismo método y los mismos materiales de modificación para los microelectrodos, se utilizará el mismo método y los mismos materiales de modificación para los microelectrodos, lo que dará lugar a una mayor sensibilidad en comparación con los electrodos convencionales. Aunque se utilicen el mismo método y el mismo material de modificación para los microelectrodos, la sensibilidad se reduce o incluso el comportamiento electroquímico es diferente en comparación con el de los electrodos convencionales. Es necesario que los investigadores sigan explorando y descubriendo los materiales y métodos de modificación de electrodos adecuados para los dispositivos de detección microelectroquímica, con el fin de garantizar la alta actividad catalítica y selectividad de los materiales de modificación, así como la precisión de la detección, y al mismo tiempo, facilitar y abaratar la detección.

 

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