Efectos de diferentes concentraciones de glutatión sobre el estrés oxidativo en eritrocitos almacenados

 Resumen: Objetivo Investigar los efectos de diferentes concentraciones de glutatión (GSH) sobre el estrés oxidativo en glóbulos rojos almacenados (sRBC). Métodos Se dividieron 12 ml de cada uno de los 6 eritrocitos recién preparados en 4 grupos: grupo ACD, grupo GSH1, grupo GSH2 y grupo GSH3, con 3 ml en cada grupo. Se añadió 1 ml de solución conservante ACD-B al grupo ACD, seguido de 50 μl de solución salina. Se añadió 1 ml de solución conservante ACD-B a los grupos GSH1, GSH2 y GSH3. Se añadieron 12,5, 62,5, 12,5 y 12,5 ml de GSH a los grupos GSH1, GSH2 y GSH3, respectivamente. A los grupos GSH1, GSH2 y GSH3 se les añadió 1 ml de solución de conservación ACD-B y 50 μl de solución de 12,5, 62,5 y 125 μmol/L de GSH, respectivamente. Los cuatro grupos se almacenaron en el frigorífico a 4 ℃. En los días 1, 7, 14 y 21 de almacenamiento, el contenido de ATP y la actividad enzimática GSH-PX en los glóbulos rojos sanos se determinaron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA), la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en los glóbulos rojos sanos se determinó mediante un ensayo de xantina oxidasa, y el contenido de malondialdehído (MDA) en los glóbulos rojos sanos se midió mediante el ensayo colorimétrico del ácido tiobarbitúrico, respectivamente.

 

En comparación con el grupo ACD, el contenido de ATP y la actividad de la enzima GSH-PX fueron significativamente mayores en los grupos GSH2 y GSH3 los días 1, 7, 14 y 21 (P<0,05), y el contenido de ATP y la actividad de la enzima GSH-PX fueron significativamente mayores en los grupos GSH2 y GSH3 en comparación con el grupo GSH1 (P<0,05). En comparación con el grupo ACD, la actividad de la enzima SOD fue significativamente mayor en el grupo GSH2 en los días 1, 7, 14 y 21 (P<0,05), y en el grupo GSH3 en los días 1, 7 y 14 (P<0,05); y en comparación con el grupo GSH1, la actividad de la enzima SOD en los grupos GSH2 y GSH3 fue significativamente mayor en el día 21 (P<0,05). En comparación con el grupo ACD, el contenido de MDA en los grupos GSH2 y GSH3 fue significativamente inferior en los días 1, 7, 14 y 21 (P<0,05); en comparación con el grupo GSH1, el contenido de MDA en los grupos GSH2 y GSH3 fue significativamente inferior en los días 1, 7 y 21 (P<0,05). Se concluyó que la adición de 62,5 y 125 μmol/L de glutatión a los glóbulos rojos sanos tenía cierto efecto contra el estrés oxidativo y podía reducir el daño por almacenamiento de los glóbulos rojos sanos.

 

Los hematíes almacenados (sRBCs) sufren un daño progresivo durante el proceso de almacenamiento con la duración del mismo. Los cambios en el daño por almacenamiento no sólo se producen a nivel metabólico, sino también en la homeostasis redox y en los cambios citoesqueléticos[1-2] . En el estudio de la mitigación de los daños de almacenamiento, nuestro equipo de investigación ha profundizado en el aumento del suministro de energía[3-4] . El glutatión reducido (GSH) puede ser uno de los mecanismos importantes que conducen al daño de almacenamiento de los glóbulos rojos[5]. El GSH puede reducir el estrés oxidativo de los glóbulos rojos y reducir el daño de los glóbulos rojos. En este experimento, añadimos diferentes concentraciones de GSH a los eritrocitos y observamos los cambios de los índices relacionados con los eritrocitos tras su almacenamiento durante diferentes periodos de tiempo para investigar el efecto del estrés antioxidante del GSH en el proceso de almacenamiento de los eritrocitos.

 

Materiales y métodos

célula experimental    

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital (KLLY-2019-028). El Departamento de Transfusión de Sangre proporcionó 6 porciones (200 ml cada una) de eritrocitos deletéreos frescos desde la preparación hasta la aplicación clínica, y se retiraron 12 ml de cada porción, y la porción restante se almacenó para su uso futuro.

Agrupación y tratamiento Se dividieron 12 ml de sRBC en cuatro grupos: grupo ácido-citrato-dextrosa (ACD), grupo GSH1, grupo GSH2 y grupo GSH3, 3 ml en cada grupo, en la mesa de operaciones aséptica. En este experimento, el gradiente de concentración de la solución de GSH fue de 12,5, 62,5 y 125 μmol/L, respectivamente, según el método de la bibliografía [6]. Se añadió 1 ml de solución de conservación ACD-B al grupo ACD, seguido de 50 μl de solución salina fisiológica, y se añadió 1 ml de solución de conservación ACD-B a los glóbulos rojos sanos de los grupos GSH1, GSH2 y GSH3, y las soluciones de GSH de 12,5, 62,5 y 125 μmol/L a los glóbulos rojos sanos de los grupos GSH1, GSH2 y GSH3, respectivamente. Se añadió solución de GSH a concentraciones de 12,5, 62,5 y 125 μmol/L a los sRBC de los grupos GSH1, GSH2 y GSH3, y después se les añadieron 50 μl de solución de GSH. Los sRBC de los cuatro grupos se almacenaron en el frigorífico a 4 ℃.

 

Método ELISA: Se colocaron 100 μl de sRBC en un tubo de centrífuga estéril los días 1, 7, 14 y 21 de almacenamiento, y el sobrenadante se centrifugó a 10 000×g durante 10 min a 4 ℃. El contenido de adenosín trifosfato (ATP) de los sRBC se detectó según el manual de instrucciones del kit de reactivos (nº de lote: BC0305). El contenido de adenosín trifosfato (ATP) en los sRBC se midió según las instrucciones del kit (BC0305). Los días 1, 7, 14 y 21 de almacenamiento, se tomaron 20 μl de sRBC, y se añadió 1 ml de agua destilada para diluir la sangre en una solución 1:49, y la solución se mezcló con una ligera agitación y vibración, y luego se dejó reposar durante 5 min hasta que la sangre fue completamente transparente a la luz. Se detectó la actividad de la glutatión peroxidasa (GSH-PX) sRBC de acuerdo con las instrucciones del kit (número de lote: A005-1). Todas las muestras se descongelaron una vez y cada muestra se midió 4 veces y se tomó el valor medio.

 

Ensayo de xantina oxidasa: se tomaron 50 μl de glóbulos rojos sanos los días 1, 7, 14 y 21 de almacenamiento, se añadió 1 ml de solución salina, se centrifugó a 500~1000×g durante 10 minutos y se aspiró el sobrenadante con una micropipeta para dejar los glóbulos rojos sanos precipitados. Tomar los glóbulos rojos precipitados después de la centrifugación y añadir 4 veces el volumen de glóbulos rojos al agua destilada (200 μl), y mezclar durante 1 minuto en un mezclador vortex para lisar completamente las células. Añadir 0,1 ml de etanol anhidro al lisado de sRBC y mezclar bien en un agitador vortex durante 30 s, después añadir 0,1 ml de triclorometano y mezclar en un agitador vortex durante 1 min, y centrifugar las células a 3.500×g durante 8 min. En este momento, el líquido se dividió en tres capas, y la capa superior era la solución de extracción de superóxido dismutasa (SOD) utilizada para el ensayo. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del kit (lote nº A001-1). Las mediciones se repitieron 4 veces para cada muestra y se tomó el valor medio.

 

Ensayo colorimétrico con ácido tiobarbitúrico: se tomaron 150 μl de sRBC los días 1, 7, 14 y 21 de almacenamiento, se añadieron 2-3 ml de solución salina, se centrifugaron a 3.000×g durante 10 min y se aspiró el sobrenadante con una micropipeta para eliminar los sRBC precipitados. Tomar el precipitado sRBC después de la centrifugación y añadir 4 veces el volumen de sRBC a agua destilada (600 μl), y mezclar durante 1 min en un mezclador vortex para lisar completamente las células. Añadir 0,3 ml de etanol anhidro al lisado de sRBC y mezclar bien durante 30 s en un mezclador de vórtice, a continuación, añadir 0,3 ml de triclorometano y mezclar durante 1 minuto en un mezclador de vórtice, y centrifugar a 3.500×g durante 10 min. En este punto, el líquido se dividió en tres capas, y la capa superior era extracto de malondialdehído (MDA) para la detección. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del kit (lote nº A003-1). Las mediciones se repitieron 4 veces para cada muestra y se promediaron.

 

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 18.0 y los gráficos se trazaron con el programa Graphpad Prism 8.0. Las medidas de distribución normal se expresaron como media±desviación estándar (±s). Las medidas de distribución normal se expresaron como media±desviación estándar (±s), y las comparaciones entre grupos se realizaron mediante análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) de dos factores. p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

 

Resultados

Contenido de ATP El contenido de ATP de los grupos GSH2 y GSH3 en los días 1, 7, 14 y 21 fue significativamente mayor (P<0,05) en comparación con el del grupo ACD. En comparación con el grupo GSH1, los niveles de ATP en los grupos GSH2 y GSH3 fueron significativamente superiores (P<0,05) (Tabla 1).

Actividad GSH-PX La actividad GSH-PX fue significativamente mayor en los grupos GSH2 y GSH3 los días 1, 7, 14 y 21 en comparación con el grupo ACD (P<0,05). La actividad GSH-PX fue significativamente mayor en los grupos GSH2 y GSH3 en comparación con el grupo GSH1 (P<0,05) (Tabla 2).

La actividad de la SOD fue significativamente mayor en el grupo GSH2 los días 1, 7, 14 y 21 en comparación con el grupo ACD (P < 0,05), y en el grupo GSH3 los días 1, 7 y 14 (P < 0,05). La actividad de la SOD fue significativamente mayor en los grupos GSH2 y GSH3 el día 21 (P < 0,05) en comparación con la del grupo GSH1 (Tabla 3).

Contenido de MDA El contenido de MDA de los grupos GSH2 y GSH3 fue significativamente inferior (P<0,05) en comparación con el del grupo ACD los días 1, 7, 14 y 21 (Tabla 4). En comparación con el grupo GSH1, el contenido de MDA en los grupos GSH2 y GSH3 fue significativamente inferior (P<0,05) en los días 1, 7 y 21 (Tabla 4).

 

debate

sRBC es el producto sanguíneo más utilizado en la clínica, y la calidad de sRBC está estrechamente relacionada con una variedad de complicaciones transfusionales [7-8]. La calidad de la solución de preservación de sRBC se ha mejorado y actualizado, y el papel de ACD, que se utiliza comúnmente como una solución de preservación en la clínica en la actualidad, es principalmente para mantener la estructura y función de sRBCs, pero todavía no puede evitar la aparición de trastornos metabólicos, estrés oxidativo, y otras reacciones que conducen al daño de los sRBCs almacenados en almacenamiento durante el período de almacenamiento. Sin embargo, no puede evitar la aparición de trastornos metabólicos, estrés oxidativo y otras reacciones durante el almacenamiento de los eritrocitos sRBC que conducen al daño de los eritrocitos sRBC almacenados. El estrés oxidativo es una causa importante de lesión eritrocitaria durante el almacenamiento[9-10] . En eritrocitos sanos, el daño oxidativo puede ser mitigado hasta cierto punto por el sistema antioxidante, que consiste en compuestos antioxidantes como GSH, vitamina E, vitamina C y enzimas (GSH-PX, catalasa y SOD)[11] . Entre ellos, el GSH reducido es el antioxidante natural más abundante presente en las células humanas[11-12] .

 

El GSH es un tripéptido (γ-glutamil-L-cisteína-glicilglicina), que tiene dos formas en el organismo: GSH reducido y GSSG oxidado, siendo el GSH reducido el mayoritario en condiciones fisiológicas. El GSH reducido puede combinarse directamente con oxidantes como el peróxido de hidrógeno para producir agua y GSSG oxidado, y también puede reducir la metahemoglobina a hemoglobina para mantener la estabilidad de las membranas eritrocitarias, y los eritrocitos con un mayor contenido de GSH sufrirán menos daños por estrés oxidativo durante el almacenamiento. Cuanto mayor sea el contenido de GSH, menos daño sufrirán los eritrocitos por el estrés oxidativo durante el almacenamiento. Por lo tanto, la adición de GSH a la solución de almacenamiento de eritrocitos sRBC ACD puede ayudar a reducir el daño por almacenamiento de los eritrocitos sRBC. En este experimento, la concentración y el volumen del líquido ACD se ajustaron estrictamente a las normas de conservación de glóbulos rojos en bancos de sangre, y la preparación de la solución de GSH se basó en el método de la bibliografía [6], en el que se prepararon soluciones de GSH con gradientes de concentración de 12,5, 62,5 y 125 μmol/L, respectivamente.

 

El daño típico de almacenamiento de sRBC es una disminución del nivel de ATP intracelular, una disminución de GSH y un aumento de GSSG[13] . El ATP es el proveedor de energía intracelular, y una disminución de su contenido afectará seriamente la actividad y función normal de los eritrocitos[14] , y los resultados del daño de almacenamiento de sRBC mediante la adición de diferentes concentraciones de GSH mostraron que el contenido de ATP fue mayor cuando se añadió GSH a los sRBC con las concentraciones de 62,5 y 125 μmol/L que el de 12,5 μmol/L de GSH, lo que sugiere que la adición de 62,5 y 125 μmol/L de GSH en la solución de almacenamiento ACD-B aumentó el contenido de ATP. Los resultados mostraron que, al mismo tiempo, la adición de GSH en concentraciones de 62,5 y 125 μmol/L dio lugar a un mayor contenido de ATP que el de 12,5 μmol/L. Esto sugiere que la adición de 62,5 y 125 μmol/L de GSH a la solución de almacenamiento ACD-B puede ralentizar la tendencia descendente del ATP, aumentar la capacidad antioxidante de los sRBC, aliviar el estrés oxidativo de las células y reducir el daño por almacenamiento de los eritrocitos.

GSH-PX es uno de los antioxidantes más importantes del organismo, que puede bloquear el daño adicional causado por los radicales reactivos del oxígeno, actuar como selenocisteína y descomponer los peróxidos lipídicos en el organismo utilizando GSH como reductor para evitar que las membranas celulares y otros tejidos biológicos resulten dañados por la peroxidación[15] . Los resultados del presente estudio mostraron que las actividades de GSH-PX y SOD fueron mayores en sRBCs con concentraciones de GSH de 62,5 y 125 μmol/L que aquellos con concentración de GSH de 12,5 μmol/L al mismo tiempo. Al mismo tiempo, las actividades de GSH-PX y SOD fueron mayores en los sRBCs que en los sRBCs con 12,5 μmol/L de GSH. Cuando se añadió GSH en concentraciones de 62,5 μmol/L y 125 μmol/L a la solución de almacenamiento ACD-B, los indicadores de ATP, GSH-PX, SOD y MDA mejoraron significativamente, lo que sugiere que la adición de cierta concentración de GSH a la solución de almacenamiento ACD-B puede aliviar el daño peroxidativo de la membrana celular, y confirma además que el GSH desempeña un papel antioxidante en la conservación de los eritrocitos.

 

En el cuerpo humano, los radicales libres actúan sobre los lípidos para producir la reacción de peroxidación, y el producto final de la oxidación es el MDA. Al añadir diferentes concentraciones de GSH a los sRBC, los resultados mostraron que, al mismo tiempo, el contenido de MDA del GSH añadido a 62,5 y 125 μmol/L era menor que el añadido a 12,5 μmol/L. Esto sugiere que la adición de GSH a 62,5 y 125 μmol/L al conservante ACD-B puede ralentizar la tendencia al aumento del MDA y mejorar la capacidad de los sRBC para eliminar los radicales libres. Se sugiere que la adición de GSH en concentraciones de 62,5 y 125 μmol/L a la solución de conservación ACD-B puede ralentizar el aumento de MDA y mejorar la capacidad de eliminación de radicales libres de los sRBC.

 

Los resultados de este estudio experimental mostraron que la adición de ciertas concentraciones de GSH (62,5, 125 μmol/L) a la solución de conservación ACD-B podía reducir el daño por almacenamiento de los eritrocitos sRBC. Sin embargo, este estudio experimental sólo comparó los efectos de tres concentraciones de GSH en los eritrocitos sRBC, y es necesario investigar más a fondo la concentración óptima de GSH para la conservación de los eritrocitos sRBC. Además, en este estudio experimental no se observaron los efectos del GSH sobre la morfología y la función de los glóbulos rojos, por lo que es necesario investigarlos más a fondo.

 

En conclusión, durante el periodo de almacenamiento de los eritrocitos conservados en la solución de conservación ACD-B, el contenido de ATP, las actividades enzimáticas GSH-PX y SOD de los eritrocitos disminuyeron gradualmente y el nivel de MDA aumentó gradualmente con la ampliación gradual del tiempo. La adición de concentraciones apropiadas de antioxidantes a la solución de conservación de eritrocitos puede mejorar la calidad de la conservación de los eritrocitos y reducir los daños de almacenamiento de los eritrocitos.

 

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