Glutatión reducido (GSH) se compone de L-hemi, γ,-[y 1-2 en], que contiene sulfhidrilo, γ-glutamilo, y otros grupos funcionales, y exhibe antioxidante, desintoxicación, eliminación de radicales libres, anti-radiación, y el mantenimiento de la función normal de las proteínas y el sistema inmunológico, etc[3] . Sin embargo, el GSH tiene un ciclo de circulación corto en el organismo, se oxida fácilmente y no puede atravesar la membrana celular, lo que limita su aplicación en el cuidado de la salud y el tratamiento médico[4- 5] . Los estudios han demostrado que la tecnología de micro y nanoincrustación puede mejorar eficazmente la estabilidad del GSH y su capacidad para atravesar la membrana celular[6] . Naji-tabasi et al.[8] utilizaron goma de semillas de albahaca para incrustar GSH, y las nanopartículas de GSH preparadas presentaban una buena estabilidad en el medio gastrointestinal. Además, Joy et al[9] descubrieron que el GSH embebido en nanopartículas liposomadas mejoraba la administración de fármacos al cerebro.
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Los liposomas, como tipo de micro vesículas formadas por bicapa lipídica envuelta en solución acuosa, son capaces de incrustar no sólo compuestos lipofílicos, sino también compuestos hidrofílicos[10] . Cuando el GSH se embebe en liposomas, la bicapa puede reducir la influencia de factores ambientales como el oxígeno y los iones metálicos sobre el GSH, y aumentar la estabilidad del GSH; además, debido a que la bicapa fosfolipídica tiene una alta afinidad por la membrana celular, es más fácil transportar el GSH al interior de la célula, y puede evitar la descomposición y destrucción del GSH, de modo que el GSH puede liberarse lentamente y puede mejorarse la biodisponibilidad del GSH[11] . Existen muchos métodos para incrustar GSH en liposomas, como el método de gradiente de pH, el método de etanol y el método de uso de etanol en el liposoma.
método de inyección, método de evaporación en fase inversa, método de ultrasonido de película fina, etc.[12] . En este documento, utilizamos
Factores que influyen (por ejemplo, cantidad de lecitina añadida, cantidad de Tween-80 añadida,
Se investigaron las interacciones de la adición de GSH, el tiempo de sonicación y la proporción entre lecitina y colesterol para obtener los parámetros óptimos del proceso de nanoliposomas con alto contenido en GSH, lo que proporcionaría una base teórica y experimental para su aplicación en las industrias alimentaria y médica.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales y reactivos
Glutatión reducido (GSH), Shandong Jincheng Bio-Pharmaceutical Co., Ltd; lecitina de soja, Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd; colesterol, Soleilbao Bio-technology Co.
1.2 Instrumentos y equipos
JY99-Ⅱ D Trituradora ultrasónica, Beijing Jiayuan Xingye Technology Co.
Ltd; etiquetadora enzimática Multiskan FC, Thermo Fisher (Shanghai) Instruments Ltd; centrifugadora 5039R, Eppendorf, Alemania;
Medidor FE20pH, METTLER TOLEDO INSTRUMENTS INC.
1.3 Método de ensayo
1 .3 . 1 Trazado de curvas patrón de GSH
La reacción produce ácido 2-nitro-5-mercaptobenzoico y disulfuro de glutatión, y el ácido 2-nitro-5-mercaptobenzoico tiene un color amarillo con un valor máximo de absorción a 412 nm[13] . Disuelva 1 mg de estándar de GSH en 1 mL de agua destilada para hacer una solución madre de GSH con una concentración en masa de 1 mg/mL. A continuación, según las instrucciones del kit de ensayo de glutatión reducido, añadir 20 μL de la solución estándar, 140 μL del reactivo 2 y 40 μL del reactivo 3 en un tubo de centrífuga, mezclar bien y dejar reposar durante 2 min antes de analizar la concentración de GSH a 412 nm. La absorbancia se midió a 412 nm tras 2 min de reposo. Se tomó la concentración másica de GSH como coordenada horizontal y la absorbancia a 412 nm como coordenada vertical, y se trazó la curva estándar de GSH.
1 .3 .2 Preparación de nanoliposomas de glutatión reducido
En este trabajo, se prepararon nanoliposomas embebidos en GSH (GLip) según el método de película fina-sonicación de Lasicd[14] . Una cierta cantidad de lecitina, colesterol y Tween-80 se disolvió en 15 mL de etanol anhidro, y la solución mezclada se vertió en un matraz de fondo redondo y se evaporó por rotación a 50 ℃ y - 0,1 MPa para eliminar la fase orgánica y formar una película homogénea y transparente en la pared del matraz. A continuación, añadir 20 mL, 0,05 mol/L, pH 6,0 de solución de PBS a 50 ℃, en condiciones de presión atmosférica para continuar la hidratación rotatoria durante 30 min para lavar la película; después de que la película se lavó, la solución de tampón fosfato (PBS) en un baño de hielo a 250 W de potencia para ultrasonidos, el procesamiento de 1 s de trabajo 1 s pausa 1 s modo, a 20 ℃ estática durante 2 h, el GLip obtenido. La muestra de GLip se transfirió al tubo interior de un tubo de centrífuga de ultrafiltración (con un corte de peso molecular de 10 kDa) y se centrifugó a 3000 r/min durante 20 min para recoger el filtrado del tubo exterior del tubo de centrífuga de ultrafiltración. Se añaden 2 mL de agua destilada al tubo interior, se vuelve a distribuir la solución concentrada GLip y se centrifuga de nuevo a 3.000 r/min durante 20 min, recogiendo el filtrado del tubo exterior del tubo de centrífuga de ultrafiltración. Este paso se repite tres veces para separar el material que no forma GLip del GLip. Por último, se retira completamente el concentrado de GLip del tubo interior del tubo de centrífuga de ultrafiltración, y el filtrado recogido se mezcla completamente y se almacena a 4 °C, a la espera de su determinación.
1 .3 .3 Determinación de la tasa de incrustación GLip
Se pipetearon 100 μL de filtrado del tubo exterior del tubo de centrífuga de ultrafiltración y se diluyeron adecuadamente. Tras la dilución adecuada, se determinó el contenido de GSH libre en el filtrado según el método descrito en 1.3.1 y la curva estándar de GSH, y se calculó la tasa de incrustación de GSH en GLip según la ecuación (1).
Tasa de incrustación ×100%, (1) donde :Wtotal es la cantidad total de GSH añadida durante la preparación; Wfree es la cantidad de GSH libre medida.
1 .3 .4 Optimización de los parámetros del proceso
En el proceso de preparación de GLip, se determinaron las cantidades de lecitina (100, 150, 200, 250, 300, 350 mg), Tween-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 mg), GSH (30, 40, 50, 60, 70, 80 mg), el tiempo de sonicación (5, 10, 15, 20, 25, 30 min) y la proporción de masa de lecitina y colesterol (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) utilizando la tasa de incrustación como indicador, Basándose en los resultados de los experimentos unidireccionales, se diseñó un experimento de análisis de superficie de respuesta con 17 puntos experimentales en tres factores y tres niveles con la adición de lecitina, GSH y Tween-80 como variables independientes.
1 .3 .5 Determinación del tamaño de las partículas GLip
1 mL de muestra de GLip se diluyó 10 veces con agua ultrapura y, a continuación, el tamaño de partícula y la carga superficial de la muestra se determinaron mediante un analizador potenciométrico de tamaño de partícula a 20 ℃, y el índice de refracción de los fosfolípidos y los medios dispersivos fue de 1 . 330. Cada muestra se midió más de 3 veces en paralelo.
1 .3 .6 Tratamiento y análisis de datos
El análisis de superficie de respuesta se llevó a cabo utilizando el programa Design-Expert V8.0.6. Se utilizó el software Design-Expert V8.0.6 para ajustar una ecuación polinómica de segundo orden, y se comprobó la significación de los coeficientes de la ecuación de regresión lineal (prueba F) para resumir los efectos de los factores individuales seleccionados sobre la tasa de incorporación de GSH en GLip. Las ecuaciones polinómicas de segundo orden obtenidas se transformaron en superficies de respuesta utilizando el software Design-Expert V8.0.6 para analizar con más detalle los efectos de los factores y niveles experimentales sobre la tasa de incorporación de GLip[15] .
2 Resultados y debate
2.1 Medición del contenido de GSH
La curva estándar de GSH según 1.3.1 se muestra en la Fig. 1. La curva estándar de GSH se trazó de acuerdo con 1.3.1 como se muestra en la Fig. 1. Como puede verse en la Fig. 1, la concentración másica de GSH mostró una buena relación lineal con la absorbancia en el rango de 0~200 μg/mL, y la ecuación lineal fue y = 0,002 1x + 0,004 7 , R2 = 0,999 2 . La concentración en masa de GSH en la muestra se calculó a partir de la curva estándar, y luego se determinó la masa de GSH.
2.2 Tamaño medio de las partículas GLip
El tamaño medio del grano de GLip fue de (77,70 ± 0,5 mm). 70 ± 0 . 87) nm , PDI de (0. 219 ± 0 .005) y potencial zeta de (- 27 .20 ± 0 .031) V. La distribución del tamaño de las partículas de esta nanoescala de GLip es relativamente uniforme y estable. 2.3 Efecto del experimento unidireccional en la velocidad de incrustación de GLip
2.3 . 1 Efecto de la adición de lecitina en la velocidad de incrustación
De acuerdo con el ensayo previo, la proporción de masa de lecitina y colesterol se fijó en 4:1, la cantidad de tween-80 fue de 100 mg y la cantidad de GSH fue de 70 mg, y se estudió el efecto de la adición de lecitina de 100, 150, 200, 250, 300 y 350 mg sobre la velocidad de incrustación de GLip. Como puede observarse en la Fig. 2, cuando la cantidad de lecitina añadida era inferior a 200 g, la tasa de incrustación de GLip era proporcional a la cantidad de lecitina añadida, lo que se debía principalmente al hecho de que el aumento de lecitina podía formar más bicapas de fosfolípidos, que podían encapsular más GSH, aumentando así la tasa de incrustación de GLip; cuando la cantidad de lecitina añadida era de 200 g, la tasa de incrustación de GLip alcanzaba el máximo, que era del 63%; cuando la cantidad de lecitina añadida era superior a 200 g, la tasa de incrustación de GLip alcanzaba el máximo, que era del 63%. Cuando la cantidad de lecitina añadida es superior a 200 g, la tasa de incrustación de GLip es básicamente la misma, lo que puede deberse al hecho de que la bicapa de fosfolípidos tiene un cierto límite para incrustar GSH, y tiende a saturarse después de alcanzar la cantidad máxima de GSH incrustado. Además, en este trabajo se adopta el método de película ultrasónica para preparar GLip, si la adición de lecitina en el sistema de preparación es demasiado alta, provocará la formación de una película irregular tras la evaporación rotatoria, y será más difícil lavar la película con solución de PBS.
2.3 .2 Efecto de la relación lecitina/colesterol en la velocidad de encapsulación
La cantidad fija de lecitina fue de 200 mg, la cantidad de tween-80 fue de 100 mg y la cantidad de GSH fue de 70 mg, y se investigaron los efectos de las proporciones de masa de lecitina y colesterol (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) en la velocidad de incrustación de GLip. Como se muestra en la Figura 3, con el aumento de la proporción de lecitina y colesterol, la tasa de incrustación de GLip aumentó y luego disminuyó, y cuando la proporción de lecitina y colesterol fue de 4:1, la tasa de incrustación de GLip alcanzó el máximo de alrededor del 55%. Esto se debe principalmente al hecho de que el colesterol es un tipo de lípido, que puede entrar en la bicapa fosfolipídica y mejorar la estanqueidad de la bicapa fosfolipídica, lo que hace que la película sea estable y mejora la tasa de incrustación de Glip. Sin embargo, cuando la proporción de lecitina y colesterol añadidos era superior a 4:1, la bicapa fosfolipídica se volvía inestable con la adición de colesterol, lo que provocaba un aumento de la permeabilidad de la membrana, e incluso dificultades en la formación de la membrana, lo que provocaba la exudación de GSH, y disminuía la tasa de incrustación de GLip[16] .
2.3 .3 Efecto de la adición de Tween-80 en la tasa de incrustación
La proporción de masa de lecitina y colesterol se fijó en 4:1, la adición de lecitina fue de 200 mg, la adición de GSH fue de 70 mg, y se investigó el efecto de la adición de tween-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 mg) sobre la velocidad de incrustación de GLip. Como se muestra en la Fig. 4, con la tendencia de adición de tween-80, la tasa de incrustación de GLip alcanzó el máximo de alrededor del 60% cuando la adición de tween-80 fue de 100 mg. El tween-80 es un tensioactivo no iónico, que puede distribuirse uniformemente en las fases acuosa y lipídica de los liposomas y encapsularse en la bicapa lipídica, formando una membrana más gruesa y haciendo más estable la estructura de la bicapa fosfolipídica. Por lo tanto, cuando la cantidad de tween-80 era inferior a 100 mg, la tasa de incrustación de GLip aumentaba con el incremento de tween-80. Se investigó el efecto de la adición de glutatión (30, 40, 50, 60, 70, 80 mg) en la velocidad de incrustación de GLip. Como se muestra en la Fig. 5, con el aumento de GSH, la tasa de incrustación de GLip aumentó y luego disminuyó, y la tasa de incrustación de GLip alcanzó el máximo de alrededor del 60% cuando la adición de GSH fue de 70 mg. Esto se debe principalmente a que el glutatión es un fármaco hidrosoluble.
La capacidad de entrar en la fase acuosa dentro de la bicapa de fosfolípidos aumenta la tasa de incrustación de los liposomas de GSH. Sin embargo, el volumen de las vesículas liposómicas es limitado y la cantidad de glutatión embebido es determinada[18] . Cuando la cantidad de glutatión añadida es superior a 70 mg, el volumen de la fase acuosa del liposoma se satura y es difícil disolver más glutatión, por lo que se reduce la tasa de incrustación de GLip.
2.3 .5 Efecto del tiempo de ultrasonido en la tasa de incrustación
La proporción de masa de lecitina y colesterol se fijó en 4:1, la cantidad de lecitina añadida fue de 200 mg, la cantidad de tween-80 añadida fue de 100 mg, y la cantidad de GSH añadida fue de 70 mg, y se investigó el efecto del tiempo de sonicación en la velocidad de incrustación de GLip. Como se muestra en la Fig. 6, con el aumento del tiempo de sonicación, la tasa de incrustación de GLip mostró una tendencia creciente y luego decreciente. Cuando el tiempo de sonicación fue de 10 minutos, la tasa de incrustación de GLip alcanzó el máximo, que fue de aproximadamente el 56%. En el proceso de preparación de liposomas, los ultrasonidos suelen utilizarse para redispersar las partículas en el sistema, a fin de obtener liposomas con partículas de pequeño tamaño y distribución uniforme, y aumentar así la estabilidad del sistema[19] . Sin embargo, cuando el tiempo de ultrasonido es demasiado largo, se potencia el efecto del ultrasonido, se destruye la estructura del liposoma y se produce una fuga de GSH, lo que a su vez reduce la tasa de incrustación de GLip.
2.4 Optimización de los parámetros de preparación de GLip
2.4 . 1 Diseño Box-Behnken
Basándose en los resultados del experimento unidireccional, está claro que cambiar la adición de lecitina
La tasa máxima de incrustación de GLip con la cantidad de lecitina, GSH y Tween-80 fue mayor que con la proporción de lecitina y colesterol y el tiempo de ultrasonido, por lo que se seleccionó la cantidad de lecitina, GSH y Tween-80.
Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los resultados de la prueba de superficie de impacto de tres factores y tres niveles se diseñaron según el principio del diseño experimental combinado del centro Box-Beknhen, con la cantidad de espigado y la cantidad de Tween-80 como variables independientes y la tasa de incrustación de GLip como variable dependiente.
2.4 .2 Establecimiento de la ecuación del modelo y prueba de significación
Los datos del cuadro 2 se analizaron utilizando la tasa de incrustación de GLip como valor de respuesta y se ajustaron a una ecuación de regresión polinómica cuadrática modelada como : Y = 63 . 92 + 3,20A + 3. 11B - 0,52C + 2,40AB - 0,75AC + 1 . 54BC - 3,74A2 - 2,28B2 - 1 .64C2 . Los resultados obtenidos en la prueba de significación de los coeficientes de la ecuación de regresión figuran en el cuadro 3.
A partir de la prueba de significación de los coeficientes de la ecuación de regresión y del análisis de la varianza (ANOVA), podemos ver que P < 0,000 1 , por lo que el modelo de regresión de la superficie de respuesta alcanza un nivel altamente significativo; y como R2 = 0,983 5 , muestra que el 98% de los datos pueden ser interpretados por la ecuación del modelo, y el valor P del término fuera de ajuste es 0,160 9 , que es insignificante, lo que significa que el modelo elegido en este experimento es adecuado para la preparación de GLip, y el modelo de la ecuación de regresión cuadrática es significativo. Esto indica que el modelo elegido en este experimento es adecuado para la preparación de GLip y el modelo de regresión cuadrática es significativo, por lo que se puede obtener la tasa de incrustación de liposomas y optimizar el proceso de preparación de liposomas. El análisis de la varianza (ANOVA) mostró que A, B, AB, BC, A2, B2 y C2 tenían un efecto significativo en la tasa de incrustación de GLip, y los coeficientes de regresión estándar de los factores eran A > B > C. El coeficiente de variación (CV) del modelo era CV = 1. El coeficiente de variación (CV) del modelo fue de 1,40%, lo que indicaba que la diferencia entre los valores predichos y los experimentales era pequeña.
2.4 .3 Análisis de los resultados de la optimización del proceso de preparación
El gráfico de la metodología de superficie de respuesta (RSM) es un trazado de contorno tridimensional en un plano bidimensional de una superficie de respuesta específica (Y) con los factores correspondientes A, B y C. Cada superficie de respuesta se analiza para dos de los factores, y el otro factor se fija en el nivel cero. Dado que el gráfico puede visualizar el efecto de los factores sobre los valores de respuesta, sus interacciones en la preparación de GLip pueden encontrarse en los gráficos de análisis de superficie de respuesta obtenidos de los experimentos.20 El efecto de las interacciones de los tres factores, adición de lecitina, adición de GSH y adición de Tween-80, sobre la velocidad de incrustación de GLip se muestra en la Fig. 7 y en la Fig. 9. - El efecto de los tres factores sobre la velocidad de incrustación de GLip se muestra en la Fig. 7 y en la Fig. 9.
Como se muestra en la Fig. 7, la superficie de respuesta muestra una pendiente más pronunciada, lo que indica que la interacción entre las adiciones de lecitina y GSH tiene un efecto más significativo sobre la tasa de incrustación de GLip. A partir de las líneas de contorno de la Fig. 7, las elipses están más densamente dispuestas en la región de adición de lecitina, lo que indica que el efecto de la adición de lecitina sobre la tasa de incrustación es mayor que el de la adición de GSH. Cuando la cantidad de GSH no se modificaba, la velocidad de incrustación aumentaba y luego disminuía con el aumento de la cantidad de lecitina, y la velocidad de incrustación alcanzaba el máximo cuando la cantidad de lecitina era de 225-250 mg. Cuando la cantidad añadida de lecitina era constante, con el aumento de GSH, la tasa de incrustación aumentaba primero y luego disminuía; cuando la cantidad añadida de GSH era de 75-80 mg, la tasa de incrustación alcanzaba el máximo.
La cáscara del liposoma es lecitina, y el volumen del liposoma formado por una cierta cantidad de lecitina es cierto, y con la adición de GSH, el volumen del liposoma se sobrecargará. Como se muestra en la Fig. 8, en el gráfico de superficie de respuesta se puede observar la pendiente más pronunciada, lo que indica que la interacción entre la cantidad de lecitina añadida y la cantidad de Tween-80 añadida tiene un efecto más evidente sobre la velocidad de incrustación. A partir de las líneas de contorno de la Fig. 8, puede verse que las elipses están más densamente dispuestas en la región de adición de lecitina, lo que indica que el efecto de la adición de lecitina sobre la tasa de incrustación es mayor que el de la adición de tween-80 sobre la tasa de incrustación. Cuando la cantidad de lecitina era constante, la velocidad de incrustación aumentaba con el aumento de la cantidad de tween-80, cuya humectabilidad aumentaba primero y disminuía después, facilitando la penetración del agua y acelerando la velocidad de desintegración; además, su fuerte solubilización y antifloculación aumentaban la disolución del fármaco, lo que disminuía la velocidad de incrustación. Cuando la cantidad añadida de Tween-80 no se modificaba, con el aumento de la cantidad de lecitina, la velocidad de incrustación era la primera en aumentar y luego disminuir, y la velocidad de incrustación más alta se alcanzaba cuando la cantidad añadida de lecitina era de 225-250 mg.
2.4 .4 Validación de las condiciones óptimas de preparación de GLip
Los parámetros óptimos para la preparación de GLip se analizaron mediante el software estadístico Design-Expert V8.0.6: 232,84 mg de lecitina, 75,91 mg de GSH y 94,30 mg de treonina-80, y la tasa de incrustación óptima prevista fue del 66,27%. Para verificar la validez del modelo, combinado con la situación experimental real, el proceso de preparación óptimo se optimizó a 232 mg de lecitina, 75 mg de GSH, 94 mg de Tween-80, y la tasa de incrustación de GLip fue de (65,85±0,54)% tras 3 repeticiones. 85±0,54)%, y el valor absoluto del error respecto a la predicción teórica fue inferior al 5%. Esto indica que los parámetros del modelo optimizado mediante la metodología de superficie de respuesta son precisos y que las condiciones óptimas de preparación son fiables, lo cual es valioso.
3 Conclusiones
En este trabajo, basado en un experimento unidireccional que utiliza la tasa de incrustación como indicador, la
Se utilizó el método de superficie de respuesta para analizar las interacciones entre los factores que afectan a la preparación de GLip mediante el método de película fina-sonicación, y se obtuvieron los parámetros óptimos para la preparación de GLip, que mejoraron la tasa de incrustación de GLip. Las condiciones óptimas de preparación fueron las siguientes: 232 mg de lecitina, 75 mg de GSH y 94 mg de tween-80, y se obtuvo una tasa de incrustación máxima del (65,85±0,54)%. Los resultados de este trabajo proporcionan una referencia para el desarrollo del sistema de nanodistribución de GSH, que puede promover aún más la aplicación de GSH en los campos alimentario y farmacéutico.
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