El glutatión (GSH) es un tripéptido reactivo formado por la condensación de ácido glutámico, cisteína y glicina. Se encuentra ampliamente en las células de plantas, animales y microorganismos, y es el compuesto sulfhidrilo no proteico más importante con importantes funciones fisiológicas. Puede utilizarse como coenzima de algunas enzimas, y tiene un efecto activador sobre algunas enzimas sulfhidriladas, y es un tipo de antioxidante para proteger enzimas y otros grupos sulfhidrilados de proteínas, y tiene un papel importante en el transporte de aminoácidos, el mantenimiento de la integridad de la membrana de los glóbulos rojos, la protección de la hemoglobina y la liberación de toxinas, etc. [1]. En la práctica clínica, el glutatión es un importante fármaco bioquímico para el tratamiento de enfermedades hepáticas, tumores, intoxicaciones, cataratas, envejecimiento y reacciones alérgicas. En los últimos años, con el descubrimiento de más funciones fisiológicas del glutatión, éste ha atraído mucha atención en los aditivos alimentarios, la medicina clínica y la nutrición deportiva, y la demanda de glutatión ha ido en aumento.
Desde que Hopkin [2] extrajo por primera vez el glutatión de la levadura, se ha estudiado ampliamente. Actualmente, la extracción con disolventes y la síntesis química son los métodos más maduros para obtener glutatión de gran pureza. Sin embargo, estos dos métodos tienen los problemas de un proceso engorroso, alto coste y facilidad para causar contaminación. Por lo tanto, el método biológico, que tiene las ventajas de unas condiciones de reacción suaves, un bajo coste y unos pasos de reacción sencillos, será el método más prometedor para la producción de glutatión en el futuro, y la obtención de cepas de alto rendimiento con un rendimiento excelente es la clave para la producción de glutatión por este método. En la actualidad, se ha informado [3-5] de que las cepas que pueden acumular más glutatión son principalmente levaduras y la mayoría de las bacterias Gram negativas, y los métodos de selección y reproducción de cepas utilizados son principalmente una combinación de mutagénesis química tradicional (nitrosoguanidina, sulfato de dietilo, metanosulfonato de etilo, etc.) y mutagénesis física (luz ultravioleta y rayos X), y las cepas mutantes obtenidas son principalmente cepas resistentes al 1,2,4-triazol y a la azida sódica, cepas resistentes a la etionina y cepas resistentes a la etionina, que pueden producir glutatión por el método. Las cepas mutantes obtenidas fueron principalmente resistentes al 1,2,4-triazol y a la azida sódica, resistentes a la etionina, sensibles a la metionina, resistentes al piruvato y resistentes al disulfuro de tetrametiltolueno. Sin embargo, en China no se ha descrito el uso de rayos Y para mutar cepas productoras de glutatión y obtener cepas de alto rendimiento marcadas como resistentes al ZnCl.
Los autores seleccionaron una cepa de Saccharomyces cerevisiae con cierta capacidad de producción de glutatión a partir de más de 200 cepas de levadura recogidas y conservadas en el laboratorio, y obtuvieron una bacteria altamente productora de glutatión que era resistente al cloruro de zinc y a la etiltionina mediante mutagénesis posterior con rayos UV y rayos Y. En este artículo, informamos de la selección y cría de esta cepa para sentar las bases de su aplicación industrial.
1 Materiales y métodos
1 . 1 Fuentes de cepas
Saccharomyces cerevisiae (S . cerevisiae), recogidas y conservadas en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica de Zhejiang. 1 .2 Medio de cultivo y condiciones de cultivo
1 .2 . 1 Medio inclinado (medio completo) y condiciones de cultivo:
Medio de cultivo: pasta de levadura 3g, mosto 3g, peptona 5g, glucosa 10g, agar 20g, volumen a 1L de agua, PH natural, 1 × 105 pa Esterilización 20min. Condiciones de cultivo: 28℃, 1~2d.
1 .2 .2 Medio de selección de placas y condiciones de cultivo: medio:
(1) Medio de selección Zncl2: medio slant + 1.360 mg/L Zncl2, pH natural, 1 × 105 pa Esterilización durante 20 min; (2) Medio de selección Etionina: medio slant
Las condiciones de cultivo: 28℃, incubado durante 5-7d. Condiciones de cultivo: 28℃, 5-7d.
1 .2 .3 Medio de siembra y condiciones de cultivo:
Medio: glucosa 18g, sacarosa 12g, peptona 30g, pasta de levadura 1g, NH4 H2 pO4 0 . 55g, (NH4)2 SO4 12g, MgSO4 -6H2 O 2g , FeSO4 -7H2 O 0 . 1g, inositol 75mg, biotina 24μg, vitamina B1 0 . 8mg, 10g de mosto de malta, y fijado a 1L de agua, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0,70 × 105 pa, esterilizada durante 30 min. Condiciones de cultivo: frasco triangular de 250mL con 30mL de medio, 28℃, incubado durante 2~3d, velocidad de agitación 200r/min.
1 .2 .4 Medio de fermentación y condiciones de cultivo:
Medio: medio de siembra + clorhidrato de L-cisteína 200mg/L, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0 . 7 × 105 pa Esterilización durante 30min. Condiciones de cultivo: frasco triangular de 250mL conteniendo 30mL de medio, volumen de inóculo del 10%, 28℃, incubado durante 3d, velocidad de agitación de 200r/min.
1 .3 Principales instrumentos
Esterilizador de vapor de presión vertical LS-B50L, Fábrica de instrumentos médicos nucleares de Shanghai; Espectrofotómetro 751-GW, Fábrica de instrumentos analíticos de Shanghai; Centrifugadora congeladora de alta velocidad de sobremesa Labofuge 400R, fabricada en Alemania.
1 .4 Tratamiento mutagénico
1 .4 . 1 Tratamiento UV:
Tomar el slant fresco cultivado durante 1~2d, lavar el cuerpo bacteriano con solución salina estéril para hacer la suspensión bacteriana, y obtener la suspensión unicelular después de la oscilación de perlas de vidrio y la filtración por algodón descremado, ajustar el número bacteriano de la suspensión para que sea de aproximadamente 108/mL, aspirar 3mL de suspensión bacteriana en una pequeña placa de Petri estéril, y luego bajo la irradiación de lámpara ultravioleta de 15W (a una distancia de 30cm), agitar con fuerza magnética.
30s, la suspensión bacteriana se diluyó adecuadamente y se aplicó a la placa bajo la luz roja en la sala estéril, y la placa se invirtió y se incubó en la incubadora a temperatura constante a 28℃ durante 5 días.
7d.
1.4.2 Irradiación con rayos Y de 60co: Para la irradiación directa se utilizaron slants de tubos de ensayo recién cultivados. La irradiación se llevó a cabo a 0,5KGY, 2,5KGY, 2,5KGY y 2,5KGY respectivamente. 5KGY, 2.0KGY y 0.5KGY, respectivamente. 0,5KGY, 2,0KGY dosis de 60coY irradiación de bacterias en los tubos de ensayo, con solución salina estéril será irradiado por la plaza inclinada en el número de suspensión de datos bacteriana, y después de la dilución adecuada recubierto con la placa, la placa se invirtió en 28 ℃ incubación a temperatura ambiente durante 5 ~ 7 d. La placa se colocó entonces en una caja de temperatura constante.
1 .5 Procedimiento de mutagénesis de cepas
Cepa de partida → Irradiación UV → Aislamiento natural → Irradiación de rayos Y 60cO → Bacterias productoras de glutatión. 1 .6 Métodos de análisis
1 .6 . 1 Medición del contenido intracelular de glutatión:
Método de derivatización con reactivo ALLOXAN, véase la bibliografía [6].
1 .6 .2 Determinación de la biomasa:
Se centrifugaron 10mL de caldo de fermentación a 4.500 r/min durante 4 min, y se recogieron los organismos. Los organismos se lavaron dos veces con agua destilada, se desechó el sobrenadante, y los organismos húmedos se secaron a 105°C hasta peso constante y luego se pesaron.
2 Resultados
2 . 1 Determinación de la cepa mutagénica de partida
Tras el cribado primario y secundario en matraces agitados de más de 200 cepas de levadura recogidas y conservadas en nuestro laboratorio, la levadura de cerveza nº 346 presentó el mayor rendimiento de glutatión y contenido de glutatión, con 36,88 mg/L de glutatión por gramo de células secas. Su rendimiento de glutatión fue de 36,88 mg/L, y su contenido de glutatión por gramo de células madre fue de 4,72 mg. Su rendimiento de glutatión era de 36,88 mg/L y su contenido de glutatión era de 4,72 mg por gramo de células secas, y se decidió utilizar la cepa 346 como cepa de partida para la reproducción por mutación.
2 .2 Selección de la concentración de zncl2 en las placas de cribado
El zn2+ es un cofactor para varias deshidrogenasas, descarboxilasas y peptidasas [7], y es un oligoelemento necesario para el crecimiento de las levaduras. A bajas concentraciones, el zn2+ puede promover el crecimiento de la levadura [8], pero a altas concentraciones, tiene efectos bactericidas y bacteriostáticos sobre la levadura. La concentración de zncl2 y la letalidad se muestran en la Fig. 1, a partir de la cual se puede ver que hay una clara relación dosis-efecto entre la concentración de zncl2 en el medio y la letalidad de las cepas experimentales, con el aumento de la concentración de zncl2, la tasa de letalidad aumenta gradualmente. Cuando la concentración de zncl2 es de 680mg/L, la letalidad es del 80%, y la letalidad es del 100% cuando la concentración de zncl2 es superior a 2.040 mg/L. En este trabajo, se seleccionó la letalidad del 93,5% de la concentración de zncl2. En este trabajo, se eligió la letalidad del 93.5% como la dosis de concentración de zncl2 1,360 mg/L para la placa selectiva.
2 .3 Tratamiento Ultravioleta Mutagénico
La cepa 346 se trató con la mutación ultravioleta, y la suspensión de la cepa mutada se extendió en medio completo y medio de selección zncl2, y las colonias individuales de crecimiento rápido con colonias grandes se seleccionaron de las placas para ser inoculadas con slant después de la incubación, y las cepas mutantes y las cepas de partida se inocularon en el medio de siembra y el medio de fermentación, respectivamente, y la biomasa y el rendimiento de glutatión se determinaron al final de la fermentación, los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.
La tabla 1 muestra que el contenido medio de glutatión y el rendimiento de las cepas resistentes a la radiación UV y mutantes zncl2 fueron superiores a los de la cepa en desarrollo y la cepa mutante resistente a la radiación UV, y la tasa positiva también fue superior a la de la cepa mutante resistente a la radiación UV, lo que demostró que el efecto de cribado del uso de zncl2 como agente de cribado para las cepas mutantes de alto rendimiento fue significativamente mejor que el del cribado aleatorio tradicional. La tabla 2 muestra que: (1) las cepas mutantes uvzn10-3 resistente a los rayos UV y zncl2 mostraron el mayor contenido y rendimiento de glutatión, con 11,38 mg de glutatión por gramo de células madre, superior al de la cepa saliente. El contenido de glutatión por gramo de células madre alcanzó los 11,38 mg, un 141,1% superior al de la cepa saliente. El contenido de glutatión por gramo de células madre fue de 11,38 mg, un 141,1% superior al de la cepa de partida. El rendimiento de glutatión fue de 92,2mg/L, que fue un 150% superior al de la cepa de partida.(2) El glutatión es un producto intracelular, y una cierta cantidad de biomasa es el requisito previo para un alto rendimiento. La cepa uvzn10-3 produjo 92,2mg/L de glutatión, y su biomasa fue de 92,2mg/L, que fue el mayor rendimiento de glutatión. 2mg/L, y su biomasa fue de sólo 8 . La biomasa de la uvzn10-5 fue de 8.2 g/L, mientras que la biomasa de la uvzn10-5 fue de 11.9 g/L. La biomasa de la cepa uvzn10-5 fue de 11,9 g/L, pero el rendimiento de glutatión fue de sólo 35,96 mg/L. La biomasa de uvzn10-5 fue de 11,9 g/L, pero el rendimiento de glutatión fue sólo de 35,96 mg/L, lo que demostró que la biomasa no era proporcional al rendimiento. Por lo tanto, las cepas mutantes con alto contenido en glutatión deben seleccionarse durante la selección de cepas, y la biomasa debe aumentarse optimizando las condiciones de cultivo, para mejorar el rendimiento.
Para evitar la impureza de la cepa causada por el fenómeno de retraso fenotípico, se aisló de forma natural la cepa mutante uvzn10-3 resistente al zncl2, y se obtuvo un aumento del 41,83% en la producción de glutatión en comparación con la cepa uvzn10-3. De la cepa purificada H8 se obtuvo un rendimiento de glutatión un 83% superior al de la cepa uvzn10-3.
2 . 4 60 Tratamiento de mutagénesis con rayos COY
H8 se utilizó como cepa de partida tras una dosis de 2 . Se utilizó H8 como cepa de partida. Después de la irradiación con radiación de 60 coY a dosis de 2,0KGY y 0,5KGY, la suspensión bacteriana mutagenizada se extendió en medio completo, medio de selección de cloruro de zinc y medio de selección de etionina, y se seleccionaron 20 colonias individuales de crecimiento rápido con gran tamaño de colonia para inocular el slant, y después se determinaron la biomasa y la producción de glutatión tras la fermentación secundaria en matraces agitados, y los resultados fueron los que se muestran en la Fig. 2.
Como puede verse en la Fig. 2, la dosis de irradiación de 0,5KGY fue superior a la de 2,5KGY. 5KGY fue mejor que la de 2,0KGY. 0KGY, lo que concuerda con el punto de vista de que las dosis bajas son favorables para la selección de cepas mutantes positivas, como se informa en muchas literaturas. En los seis grupos de experimentos, la dosis de irradiación de 0,5KGY fue mejor que la de 2,0KGY. Entre los seis grupos de experimentos, las cepas irradiadas con 0,5KGYY y recubiertas en placas de etionina mostraron los mejores resultados, no sólo la amplitud de mutación positiva fue grande, sino también la amplitud de mutación positiva fue alta. Esto se debe al hecho de que la etionina es un análogo metabólico del glutatión, y la cepa mutante resistente a la etionina puede liberar eficazmente la regulación de retroalimentación de la propia bacteria, por lo que este modo de cribado es propicio para la selección de cepas mutantes positivas. Entre los mutantes irradiados con rayos Y, el mutante 0,5Eth400-5 resistente a la etionina presentaba las siguientes características. Entre las cepas mutantes irradiadas con rayos Y, la mutante 0.5Eth400-5 resistente a la etionina fue la mejor, con un rendimiento de glutatión de 165,96 mg/L, superior al de la mutante original. El rendimiento de glutatión de esta cepa fue de 165,96 mg/L, un 350% superior al de la cepa original, y el contenido de glutatión por gramo de células madre fue de 19,76 mg, superior al de la cepa original. El rendimiento de glutatión de esta cepa fue de 165,96 mg/L, un 350% superior al de la cepa original. El rendimiento de glutatión de esta cepa fue de 165,96 mg/L, un 350% superior al de la cepa original.
2 . 5 Examen de la estabilidad de las cepas mutantes
La estabilidad del gen de alto rendimiento de B. glutamicum se investigó mediante los métodos de población sucesiva y transmisión periódica en crioconservación. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los resultados mostraron que la cepa 0.5Eth400-5 se transmitió en el slant durante 10 generaciones consecutivas. 0.5Eth400-5 se transmitió en el slant durante 10 generaciones consecutivas, y la producción de glutatión disminuyó un 10,7%. 7%. Al mismo tiempo, la cepa se almacenó en un frigorífico de 4℃ a baja temperatura, y la producción de glutatión sólo disminuyó un 6% en 4 generaciones, lo que indica que la cepa mutante tiene una buena estabilidad, pero es necesario volver a fortalecer la cepa con regularidad.
3 Debate
3 . 1 Búsqueda de mutantes resistentes al cloruro de zinc
Intracelularmente, el glutatión es oxidado a glutatión oxidado (GSSG) por la glutatión peroxidasa (GSH-PX) como resultado de su participación en los antioxidantes internos (por ejemplo, la eliminación del H2 02 producido metabólicamente por los eritrocitos), y el GSSG es convertido a glutatión reducido activo por la glutatión reductasa. En la reacción (2), la glutatión reductasa es una enzima reguladora y es inhibida por el zn2+ intracelular. A cierta cantidad, el centro activo de la glutatión reductasa se deforma e inactiva, deteniendo la producción de GSH [9]. Cuando el zn2+ intracelular alcanza un nivel en el que las células bacterianas no pueden descomponer los óxidos fuertes tóxicos, mueren. La cepa mutante resistente al cloruro de zinc uvzn10-3 fue capaz de crecer en placas de znCl2 con alto contenido en znCl2, lo que alivió la inhibición de la glutatión reductasa por el zn2+. Por lo tanto, la adición de znCl2 al medio de cultivo puede promover el crecimiento de la levadura y aumentar la biomasa sin inhibir la reducción de GSSG, incrementando así la producción de glutatión.
3 .2 Cribado de cepas mutantes resistentes a la etionina
La biosíntesis del glutatión está controlada directamente por la sintasa mediante el siguiente mecanismo:
Ácido L-glutámico + L-cisteína glutamilcisteína (1)
Y-glutamilcisteína + glicina Glutatión (2) La reacción (1) es la etapa de control de la biosíntesis del glutatión, catalizada por la Y-glutamilcisteína sintetasa (GSH-I), una enzima reguladora, que está sujeta a una inhibición por retroalimentación por parte del producto final glutatión. Cuando una cierta cantidad de glutatión se acumula intracelularmente, el glutatión se une al sitio regulador en la molécula de la enzima e inactiva el centro activo de la enzima, inhibiendo así la síntesis posterior de glutatión [4]. La etionina es un análogo metabólico del glutatión, que también se une al sitio regulador de la GSH-I. Dado que la etionina no participa en la síntesis de proteínas, su concentración en la célula no disminuirá, por lo que es difícil restablecer la actividad enzimática de GSH-I tras la unión, y la bacteria no podrá seguir sintetizando GSH, y morirá debido a la acumulación de un exceso de sustancias tóxicas en la célula.
Utilizando un mutante resistente al cloruro de zinc como cepa de partida, se seleccionó mediante 60COY una cepa mutante resistente al análogo del metabolismo del glutatión, el ácido etionico, que podía eliminar eficazmente la inhibición por retroalimentación del GSH-I por el glutatión, y aumentar así el contenido de glutatión en la bacteria.
3 .3 Conclusión
Se obtuvo una cepa mutante 0.5Eth400-5 resistente al cloruro de zinc y a la etionina mediante mejoramiento por inferencia utilizando datos de líneas extracuadradas y radiación 60COY para mutagenizar la cepa de partida. 5Eth400-5 se fermentó en matraces agitados y produjo 165,96mg/L de glutatión. La fermentación de esta cepa dio como resultado un rendimiento de glutatión de 165,96mg/L, con 19,26mg de glutatión por gramo de células madre. 19,26mg de glutatión por gramo de células madre. Este experimento demostró que el uso de la resistencia al cloruro de zinc y a la etionina como modelos de cribado puede seleccionar y criar bacterias altamente productoras de glutatión.
Referencias:
[1] Zheng Yunlang . Boletín Biológico, 1995, 30(5): 22 ~ 24 . [2] Hopkins F G. J Biochem, 1921, 15: 286 ~ 305 .
[3] Murata K, Kimura A. Biotechnol Adv, 1990, 8(1): 59 ~ 96 .
[4] Zhan Gu-Yu, Tian Ping, Liu We-Dong, et al. Journal of Pharmacy, 1990, 25(7): 494 ~ 499 . [5] Kimura A, Murata K. Patente de Estados Unidos 4, 598, 046, 1986-07-01 .
[6] Shen Beiying, Jiang Zhiwei. Grano y aceite, 1993, 2: 27 ~ 32 .
[7] Zhou Deqing . Tutorial de microbiología . Pekín: Higher Education Press, 1993 . 104 ~ 105 .
［8］Alimentos Chan Sze-foon, Siu Hee-pui. Bioquímica de la levadura . Jinan: Shandong Science and Technology Press, 1990 . 61 .
[9] walther U I, wilhelm B, walther S. In vitro Mol Toxicol, 2000, 13(2): 145 ~ 151 .
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